双酶催化法合成1－β－D－呋喃核糖苷－1，2，4－三氮唑－3－甲酰胺

摘要

本发明公开了一种双酶催化法合成三氮唑核苷的新方法。该方法是在磷酸缓冲液(pH7～pH8)中，以肌苷和三氮唑甲酰胺作为反应底物，以黄嘌呤氧化酶和核苷磷酸化酶作为催化酶，催化合成三氮唑核苷。采用该方法具有反应时间短，产物得率高，而且所用的酶源便宜易得，操作处理容易，便于储存和重复使用等优点。

主权项

1、一种双酶催化法合成1-β-D-呋喃核糖苷-1，2，4-三氮唑-3-甲酰胺的方法， 其特征在于：pH7～pH8的磷酸缓冲液中，以肌苷和三氮唑甲酰胺作为反应底物， 以黄嘌呤氧化酶和核苷磷酸化酶作为催化酶，反应底物的浓度为10mMol/L～ 200mMol/L；反应底物的投料比为，肌苷∶三氮唑甲酰胺＝1∶1～1∶1.5；反应温度为 40℃～50℃；摇床反应时间为6～20小时；反应结束后，分离菌体，从反应清液收 集1-β-D-呋喃核糖苷-1，2，4-三氮唑-3-甲酰胺； 用作核苷磷酸化酶的酶源由以下方法制得：乙酰短杆菌ATCC39311，菌种 振荡培养于100ml，pH7.2的，2％的营养肉汤中；培养温度为28℃；培养时间为 24小时；培养结束后，用离心法收集菌体，再用0.9％KCl溶液洗涤菌体一次， 用离心法收集菌体，再加pH7.2～pH7.5的10mMol的磷酸缓冲液，使成5ml细胞 悬液，置65℃过夜，次日，用离心法收集菌体，加pH7.2～pH7.5的10mMol的 磷酸缓冲液，使成5ml细胞悬液，备作核苷磷酸化酶用； 用作黄嘌呤氧化酶的酶源由以下方法制得：阴沟肠杆菌ATCC7256或球形 节杆菌ATCC8010菌种振荡培养于100ml，pH7.2的，诱导培养基中，培养温度 为28℃，培养时间为16小时；诱导培养基的配方为0.1％黄嘌呤，或0.1％次黄 嘌呤；10％基础盐培养基XS，0.01％酵母膏； 其中的，基础盐培养基XS的配方为：68gKH₂PO₄，87gK₂HPO₄，100mgCaCl₂， 2gMgSO₄7H₂O，5mgFe(NH₄)₂(SO₄)₂6H₂O，用KOH调pH7.2；培养结束后，用 离心法收集菌体，再用0.9％KCl溶液洗涤菌体一次，用离心法收集菌体，再加 pH7.2～pH7.5的10mMol的磷酸缓冲液，使成5ml细胞悬液，置40℃过夜，次日， 用离心法收集菌体，加pH7.2～pH7.5的10mMol的磷酸缓冲液，使成5ml细胞悬 液，备作黄嘌呤氧化酶用； 球形节杆菌ATCC8010的培养与制备方法与阴沟肠杆菌ATCC7256相同。