醋酸锂介导的香菇基因转移技术

摘要

醋酸锂介导的香菇基因转移技术。受体原生质体的酶解液中加入渗透稳定剂,外源目的基因的前处理以醋酸锂为介导质,在原生质体中依次加入聚乙二醇、醋酸锂、单链运载DNA、外源质粒DNA和无菌水,构成反应液。将反应液培养、离心、分离混合物,得到转化后的原生质体;将转化后的原生质体与培养基混合,摇动培养,然后移入固体培养基上培养。本发明转化效率高,转化成本低,所需设备和条件简单,便于普及推广。

主权项

1、醋酸锂介导的香菇基因转移技术，采用常规的“碱裂解法”来提取外源目的基因的质粒DNA，提取后的质粒DNA采用PEG分级沉淀法纯化，用紫外吸收法检测质粒DNA浓度和纯度，浓度要求达到1毫克/毫升，纯度要求达到OD260/OD280≥1.8，OD260/OD230≥2.0，并在1％水平琼脂糖凝胶上电泳，检测质粒大小，然后放入-20℃冰箱内待用，其特征在于其方法还包括：A、受体原生质体的制备；以浓度为0.4～0.8摩尔的甘露醇或蔗糖或氯化钾作为渗透稳定剂，在渗透稳定剂加入溶壁酶，配制浓度1.5～3％的溶壁酶酶解液，取培养3～10天的香菇菌丝球，放入酶解液中，在20～35℃条件下进行酶解，制备受体原生质体，经过滤纯化，使受体原生质体浓度在106个/毫升以上；B、外源目的基因的导入按以下步骤进行：(1)取制备好的受体原生质体纯液，进行离心，弃上清液，再用浓度0.6摩尔甘露醇洗涤—离心2次以上，洗去培养基的成份；(2)加入浓度为0.1～0.5摩尔的醋酸锂与受体原生质体混合，进行高速离心，吸除醋酸锂，再用0.1～0.5摩尔的醋酸锂与受体原生质体混合，调整受体原生质体浓度，要求受体原生质体数在106～109个/毫升之间；(3)制备外源运载DNA：将单链运载DNA加入缓冲液中，浓度为2微克/毫升，煮沸，然后迅速在冰水中冷却，待用；(4)取第(2)步得到的原生质体进行离心，去掉醋酸锂，得到前处理的纯原生质体；(5)在纯原生质体中依次加入浓度50～60％的聚乙二醇、浓度为1.0～1.2摩尔的醋酸锂、外源单链运载DNA、外源质粒DNA和无菌水，构成反应液，体积比为：聚乙二醇占50～60％，醋酸锂10～15％，外源运载DNA12～15％，其余为无菌水，使反应液中受体原生质体数在106～109个/毫升之间；质粒DNA含量1.0～20微克/毫升；(6)充分混匀反应液，然后在25～35℃下培养；(7)在35～45℃水浴中摇动培养20～40分钟；(8)将反应液离心，然后将转化混合物吸除，得到转化后的原生质体；(9)在MYG培养基中加入蔗糖，使培养基的蔗糖浓度为0.4～0.6摩尔，将转化后的原生质体与培养基混合，摇动培养20小时以上，然后移入固体培养基上培养。