摘要 |
本发明是根据TPA的结构特点,在将TPA分子中指状区和Kringle1区去掉的基础上,将TPA分子中PAI-1结合位点氨基酸进行突变,构建具有TPA活性且其活性不被PAI-1抑制的新一代TPA突变体。主要内容是扩增出天然TPA氨基酸1-3和176-527的DNA序列。将TPA DNA中PAI-1结合位点,核苷酸序列373-384的AAG CAC AGG AGG改变为GCG GCC GCG GCG,使相应的氨基酸KHRR突变为AAAA,构建了新的TPA突变体,并克隆于大肠杆菌表达载体。在大肠杆菌中得到高效表达。表达蛋白占总菌体蛋白的30%,以包涵体形式存在。经蛋白质复性,得到了有活性的TPA突变体。将新的TPA突变体,克隆于比赤酵母分泌型表达载体,在培养上清中得到高活性的TPA突变体。在大肠杆菌和比赤酵母表达的新的TPA突变体与PAI-1反应后TPA活性无抑制。说明核苷酸序列373-384和其相对应的氨基酸序列影响PAI-1结合活性,而不影响其纤溶酶原水解活性。故本发明涉及针对一种新型TPA突变体的核苷酸序列和结构及其成为治疗活性好、用量少的治疗心肌梗塞和脑血栓等血栓性疾病的新型生物工程药物。 |