| 主权项 |
1.一种制备重组双股DNA加州苜蓿银纹夜娥(Autographa californica)细胞核多面体病毒(AcMNPV)的方法,其包含 : (a)于一种双股DNA AcMNPV,于其中插入至少一种不会 切病毒基因体之核酸内切限制监识部位,以创造 一种直接结合AcMNPV载体;转殖入 (b)一段DNA片段,其含经选择末端,故当(a)之直接结 合AcMNPV载体被适当核酸内切限制切割后,该DNA片 段可于活体外结合至(a)之直接结合AcMNPV载体上。2 .根据申请专利范围第1项之方法,其中将两种不会 切病毒基因体之核酸内切限制监识部位插入病 毒基因体以创造直接结合AcMNPV载体。3.根据申请 专利范围第1项之方法,其中该DNA片段系插于病毒 基因体中对病毒于培养细胞内之复制非必要之任 何区域内。4.一种制备调节者表现载体之方法,该 方法包括将质体载体黏合一病毒插入单位,其中该 病毒插入单位包含依下列次序之: (a)核酸内切限制之监识部位; (b)含启动子与5'非转录区域(UTR)之启动子调节子, 于其中该5' UTR系自转录启始部位延伸至蛋白质合 成转译启始密码前之最后一个硷基对; (c)多连接子调节子,有助于异种基因之插入; (d)3' UTR调节子,其中含至少一个供3'端mRNA处理与聚 腺化之部位; (e)核酸内限制之监识部位。 且使(a)与(e)之监识部位允许病毒插入调节子于活 体外结合至直接结合AcMNPV载体。5.根据申请专利 范围第4项之方法,其中(a):核酸内切限制监识部 位选自Bsp MI与Esp 3I监识部位所;(b)启动子调节子之 启动子与5' UTR选自AcMNPV 6.9K基因,AcMNPV DA26基因, AcMNPV多面体蛋白基因,AcMNPV 35K基因及黄猩猩果蝇( Drosophilia melanogaster)hsp70基因之异种启动子与5' UTR; 及(c)3' UTR调节子选自(a)AcMNPV 6.9K基因之3' UTR及(b) 包含35K基因3'端以及AcMNPV类似性区域5(hr5)之区域 。6.根据申请专利范围第4项之方法,其中该多连接 子调节子藉编码异种蛋白质之核酸序列之插入而 改变。7.根据申请专利范围第6项之方法,其中该异 种蛋白质系 AaIT。8.根据申请专利范围第6项之方 法,其中该编码异种蛋白质之核酸序列包括编码讯 号序列之核酸序列,其系选自黄猩猩果蝇之角质层 讯号序列,来自家蚕(Bombyx mori)之卵壳(Chorion)讯号 序列,来自菸草天娥(Manduca sexta)之不完全脂质孔蛋 白讯号序列,来自家蚕之性别专一讯号序列,来自 菸草天蛾之脂质激动化激素讯号序列,来自家蚕之 pBMHPC-12讯号序列及来自黄猩猩果蝇之酯化酯-6讯 号序列。9.一种制备重组双股DNA AcMNPV之方法,其包 含: (a)于双股DNA AcMNPV,其中插入两种不会切病毒基因 体之核酸内切限制监识部位以创造直接结合 AcMNPV载体;转殖入 (b)DNA片段,其含经选择末端,故当(a)之直接结合 AcMNPV载体被适当核酸内切限制切割后,该DNA片段 可于活体外结合至(a)之直接结合AcMNPV载体,其中该 DNA片段含包含依下列次序之病毒插入子调节子: (1)核酸内切限制之监识部位; (2)含启动子与5'非转录区域(UTR)之启动子调节子, 于其中该5' UTR系自转录启始部位延伸至蛋白质合 成转译启始密码子前最后一个硷基对; (3)多连接子调节子,因插入编码异种蛋白质之核酸 序列而改变; (4)3' UTR调节子,其中含至少一个供3'端mRNA处理与聚 腺化之部位;及 (5)核酸内切限制之监识部位。10.一种制备直接 结合AcMNPV载体之方法,其中该载体包含双股DNA AcMNPV,于其中插入至少一种不会切病毒基因体之核 酸内切限制之监识部位,使得当直接结合AcMNPV载 体经适当核酸内切限制切割后,可将一段DNA片段 于体外结合至直接结合AcMNPV载体上。11.根据申请 专利范围第10项之方法,其中将两种不会切病毒基 因体之核酸内切限制监识部位插入病毒基因体 中。12.根据申请专利范围第10项之方法,其中该DNA 片段系插于病毒基因体中对病毒于培养细胞内之 复制非必要之任何区域内。图式简单说明: 图1描绘AcMNPV基因体某些已知杆状病毒基因之线形 图谱。 图2描绘部份AcMNPV DNA之三核酸使用频率。 图3描绘部份AcMNPV DNA之四核酸使用频率。 图4描绘命名为NW 33.2之质体,其中包括插入AcMNPV Eco RI "I" 片段中独特Eco RV部位之Bsu-Sse连接子。亦绘 出该40硷基对(bp)连接子之核酸序列。 图5描绘用于组合p74-缺陷直接结合病毒载体之p 74-1转移载体之组合通用流程。图5亦描绘含有p74 开放式阅读架构之残基1-69(起于ATG启始密码子),64 pb之多连接子(其中包括Bsu-Sse连接子)及p74开放式 阅读架构之残基1287-1937(至TAA终子密码子)之转移 载体部份。向左与向右之箭头标明用于以PCR为基 础之p74-缺陷直接结合病毒载体监定之寡核酸位 置。 图6描绘部份之调节者表现载体,于该部份中带有 于相反两端为Bsu 36I及Sse 8387I部位之表现匣,而该 表现匣中则含启动子调节子,多连接子调节子及3' UTR调节子。该多连接子调节子中含Bsp MI监识部位 。由最外层Bsu 36I与Sse 8387I部位所连结之区域则定 义为病毒插入调节子。 图7描绘构筑载体NW46.50之流程图,其中该载体系含 AcMNPV 6.9k基因启动子及3' UTR之以Bsp MI为基础之调 节子表现载体。 图8描绘命名为NW寡核酸1与PD寡核酸23之引子 核酸序列,并同时描绘放大自AcMNPV Hind III片段 "H" 模版之片段核酸序列。位置之编号系相对于6.9K 基因之转译启始部位,于其中该转译启始部位则派 定为位置+1。衍生自合成DNA引子之序列下方划线 。经放大DNA片段中之非病毒多连接子序列系以小 写字母显示。 图9描绘命名为NW寡核酸2与NW寡核酸3之引子核 酸序列,并同时描绘放大自AcMNPV Hind III片段"H"模 版之片段核酸序列。衍生自合成DNA引子之序列 下方划线。经放大序列中以大写字母表示者相对 应于AcMNPV 6.9K基因之完整3' UTR。经放大DNA片段中 之非病毒多连接子序列则以小写字母显示。 图10描绘部份之调节者表现载体,于该部份中带有 于相反两端为Bsu 36I及Sse 8387I部位之表现匣,而该 表现匣中含启动子调节子、多连接子调节子及3' UTR调节子。而该多连接子调节子中含Esp 3I监识部 位。由最外层Bsu 36I与Sse 8387I部位所连结之区域则 定义为病毒插入调节子。 图11描绘命名为DA26FZ及DA26RZ之引子核酸序列,同 时描绘放大自AcMNPV Pst I片段"G"模版之片段核酸 序列。位置之编号相对于DA26基因之转译启始部位 ,其中该转译启始部位则派定为位置+1。衍生自合 成DNA引子之序列下方划线。经放大DNA片段中之非 病毒多连接子序系以小写字母显示。 图12描绘命名为35KPR01及35KPR02之引子核酸序列, 同时描绘放大自AcMNPV Hind III片段"K"模版之片段核 酸序列。位置之编号相对于35K基因之转译启始 部位,其中该转译启始部位则派定为位置+1。衍生 自合成DNA引子之序列下方划线。经放大DNA片段中 之非病毒多连接子序列系以小写字母显示。 图13描绘命名为69KFZ及69KRZ之引子核酸序列,同时 描绘放大自AcMNPV Hind III片段"H"模版之片段核酸 序列。位置之编号系相对于6.9K基因之转译启始部 位,其中该转译启始部位则派定为位置+1。衍生自 合成DNA引子之序列下方划线。经放大DNA片段中之 非病毒多连接子序列系以小写字母显示。 图14描绘命名为PHF及PHR之引子核酸序列,同时描 绘放大自AcMNPV Hind III片段"F"模版之片段核酸序 列。位置之编号系相对于多面体蛋白之转译启始 部位,其中该转译启始部位则派定为位置+1。衍生 自合成DNA引子之序列下方划线。经放大DNA片段中 之非病毒多连接子序列系以小写字母显示。 图15描绘命名为DMHSP70F与DMHSP70R之引子核酸序列, 同时描绘放大自果蝇基因座87C1之片段核酸序列 。位置之编号系相对于hsp 70之转译启始部位,其中 该转译启始部位则派定为位置+1。位置-242之垂直 箭头标示hsp70基因之主要转录启始部位。衍生自 合成DNA引子之序列下方划线。经放大DNA片段中之 非病毒多连接子序列系以小写字母显示。 图16描绘命名为35KHR5A与35KHR5B之引子核酸序列, 同时描绘放大自AcMNPV Hind III片段"Q"模版之片段核 酸序列。附注"35K TER"标示35K基因之终止密码子 。垂直之箭头标示35K基因之聚(A)添加部位。附注" EcoRI"标示hr5之特色性IR24重覆元素。衍生自合成DNA 引子之序列下方划线。经放大DNA片段中之非病毒 多连接子序列系以小写字母显示。 图17A描绘用于角质层讯号/密码子最佳条件化之 AaIT基因放大之聚合连锁反应(PCR)技巧,然后以Bam HI消化。图17B描绘命名为PD寡核酸31与PVL反转之 引子核酸序列,其中该等引子系用来放大来自命 名为pAC0055.1之质体之序列,同时描绘于已放大产物 中角质层讯号与AaIT之核酸与胺基酸序列。衍生自 合成DNA引子之序列下方划线。 图18描绘一种调节者表现载体(AC0076.1)一部份之图 示及完整之推测核酸序列,其中该调节者表现载 体系藉将角质层讯号/密码子最佳条件化之AaIT插 入pMEV1而形成,且含AcMNPV DA26启动子。 |
