定量测定骨形成蛋白(BMP)活性细胞株的建立方法

摘要

本发明公开了一种定量测定骨形成蛋白(BMP)活性细胞株的建立方法,利用分子生物学转基因技术将BMP作用靶分子骨钙素的部分启动子(串联6个关键作用元件)连同荧光素酶报告基因,转入成肌细胞C2C12中,经过筛选获得稳定表达荧光素酶报告基因的单克隆细胞株,并检测各细胞株对BMP作用的反应性;最终挑选到对BMP刺激反应强度高、检测指标(荧光素酶)灵敏的细胞株。经过特异性、稳定性等检验,证实该细胞株稳定可靠通过检测多批BMP样品结果显示,BMP的作用剂量大小与荧光素酶活性高低呈良好的线性正相关。本发明所建立的细胞株适用于BMP活性的定量测定。

主权项

1.定量测定骨形成蛋白(BMP)活性细胞株的建立方法，包括以下步骤：a.首先将串联6个BMP作用关键元件的骨钙素部分启动子连接上荧光素酶报告基因，克隆、构建其真核表达载体；该启动子序列为：5’-CCAAC CACACCAAC CACA CCAAC CACA CCAAC CACA CCAAC CACA CCAAC CACAGCC GAT ATA AAT GCT ACT GGA TGC TGG AGG GTG CAG AAC AGA CAAGTC-3’；b.然后转入成肌细胞C2C12中，利用载体本身的抗性基因用抗生素进行压力筛选，获得稳定表达荧光素酶报告基因的单克隆细胞株；荧光素酶报告基因的表达产物为荧光素酶，荧光素酶的活性可通过检测其分解底物产生荧光量测得；上述真核表达载体也可转入其它细胞系，如NIH3T3、C3H10T1/2细胞中；具体检测方法为：收集BMP刺激、培养2天的单克隆细胞，加入细胞裂解液，待细胞完全裂解后高速离心5分钟，然后取部分离心上清，加入到一定量的荧光素酶作用底物液中，在化学发光检测仪上测定产生荧光量；c.通过检测各细胞株对BMP作用的反应性，最终挑选到对BMP刺激反应强度高、检测指标—荧光素酶分解产生荧光量灵敏的细胞株；d.经过特异性、稳定性等检验证实，该细胞株稳定可靠，适用于BMP活性的定量测定。