构建多功能基因工程菌生产聚β－羟基丁酸酯的方法

摘要

本发明涉及一种构建多功能基因工程菌制备聚β-羟基丁酸酯的方法，即分别以大肠杆菌或真养产碱杆菌为宿主菌，将透明颤菌血红蛋白合成基因，λ噬菌体裂解基因以及PHB合成基因转入宿主中，从而构建出新菌株。将菌株在含葡萄糖的LB培养基中进行摇瓶培养，最后用螯合剂溶液诱导，使细胞裂解，将胞内的PHB释放出来。本发明的方法在发酵工业中具有广阔的推广和应用前景。

主权项

1、一种构建多功能基因工程菌生产聚β-羟基丁酸酯的方法，其特征在于，该方法由以下步骤组成：(1)、首先采用分子克隆操作制备大肠杆菌和真养产碱杆菌的感受态细胞：从菌体的固体平板上挑取单菌落，接种于装有3-10毫升的LB液体培养基的试管中，液体培养基的组成为：酵母浸膏粉：5g/L，蛋白胨：10g/L，氯化钠：10/gL，pH7.0，在25-38℃的温度下于150-300转/分钟的摇床上培养6-15小时；取0.1-1.0毫升培养液接种于装有50-100毫升LB液体培养基的三角瓶中，在25-38℃的温度下于150-300转/分钟的摇床上培养至吸光度OD600为0.3-1.0；将培养液转入预冷的已灭菌离心管中，冰浴冷却5-20分钟后于2-6℃的离心机上以3000-8000转/分钟的转速离心5-20分钟；倒出培养液，在无菌条件下将管倒置1-3分钟以使残留的培养液流尽；加5-25毫升用冰预冷的0.1mol/LCaCl2重悬每份沉淀，冰浴放置5-25分钟；于2-6℃的离心机上以3000-8000转/分钟的转速离心5-20分钟，弃上清；用1-5毫升用冰预冷过的0.1mol/L CaCl2再次重悬每份沉淀，最后在冰上放置片刻即得到感受态细胞，将制好的感受态细胞转移到已灭菌的1.5毫升离心管中，每管100-500微升；(2)、在第一步制备好的感受态细胞中加入体积小于10微升、质量小于50纳克的携带透明颤菌血红蛋白基因的质粒pBR322-vgb，进行质粒的转化：混匀内容物，在冰上放置10-50分钟；接下来在42℃的循环水浴中，放置30-150秒，再冰浴1-10分钟后，每管加入0.5-5毫升的LB培养基，在25-38℃水浴或培养箱中温浴20-120分钟，将50-200微升已转化的感受态细胞涂布到含有相应抗生素的LB固体平板上，将平板置于室温下直至液体被吸收，倒置平板，于25-38℃培养箱中培养10-30小时后，即出现重组菌的菌落，完成质粒的转化；(3)、从转化后的重组大肠杆菌E.coli JM105-pBR322-vgb的固体平板上挑取单菌落，接种于装有1-10毫升的LB液体培养基的试管中，在25-38℃的温度下于150-300转/分钟的摇床上培养6-15小时；对收获的菌体采用试剂盒法提取并纯化其中的质粒pBR322-vgb，从而得到扩增的含透明颤菌血红蛋白基因的质粒pBR322-vgb；(4)、采用限制性核酸内切酶对质粒pBR322-vgb进行透明颤菌血红蛋白基因片段的酶切分离，酶切温度为25-38℃，时间为1-5小时，酶切后的vgb片段用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收；(5)、将酶切收获的透明颤菌血红蛋白基因与PHB合成基因及λ噬菌体裂解基因采用常规克隆操作进行基因重组，并引入宿主大肠杆菌和真养产碱杆菌中，构建多功能基因工程菌；(6)、在含葡萄糖的LB液体培养基中对新构建的基因工程菌进行培养：种子液为试管培养液，接种量为1％-10％，培养基体积为30-100毫升，pH6.0-8.0，摇床转速为150-300转/分钟，培养温度为35-38℃，当细胞生长约24-36小时后，用离心机以4000-8000转/分钟的转速，离心10-20分钟，弃上清液，收获离心后的细胞；(7)、用紫外照射、电击、冻融中的任何一种物理方法或乙二胺四乙酸二钠盐溶液和氯仿等化学试剂诱导细胞裂解，释放出胞内的聚β-羟基丁酸酯，菌悬液在离心机上以4000-8000转/分钟离心10-20分钟，收集沉淀，于60-80℃烘箱中烘干24-48小时，即获得本发明的产品聚β-羟基丁酸酯。