| 主权项 |
1.一种鱼类1-类胰岛素生长因子II(1-IGF-II)起动子区 域之编码序列,其去氧核醣核酸序列如下列序列编 号NO 1所示,其中序列编号NO 1的去氧核醣核酸之序 列乃条列于下:2.一种重组的鱼类1-类胰岛素生长 因子II起动子编码序列,其系选自至少一种具有序 列编号NO 2.NO 3.NO 4.NO 5.NO 6所示之寡核酸所构成 之族群,其序列乃条列于下:3.如申请专利范围第2 项所述之鱼类重组1-类胰岛素生长因子II起动子, 其中该寡核酸包括序列编号NO 6的去氧核醣核酸 序列,其序列乃条列于下:4.如申请专利范围第2项 所述之鱼类重组1-类胰岛素生长因子II起动子,其 中该寡核酸序列包括序列编号NO 4.NO 5.以及NO 6, 其序列乃条列于下:5.一用以放大如申请专利范围 第2项所述之鱼类重组1-类胰岛素生长因子II起动 子编码序列之引子,其中该引子系选自序列编号NO 7.NO 8.NO 9.及NO 10所构成之族群,其序列乃条列于下: 6.一种鱼类2-类胰岛素生长因子II起动子区域编码 序列,其去氧核醣核酸序列如下列序列编号NO 13所 示,其中序列编号NO 13之去氧核醣核酸序列乃如下 所示:图式简单说明: 第1图显示PCR引子的设计,其为研究:(1)IGF-I互补去 氧核醣核酸(cDNA)的选殖(IGF-I引子1和2)。(2)IGF-I基 因体DNA的选殖(IGF-I表现序列引子1-6)。(3)5'端快速 放大cDNA端子(5'-RACE)(IGF-I GSP1和IGF-II CSP1)。(4)IGF-I 起动子(IGF-I P2-P7)。(5)IGF-II起动子(IGF P3-P9和P11)。 以及(6)检查IGFs起动子驱动绿色萤光蛋白质表现( GFP)(GFP 1和GFP2)。W=A或T;Y=C或T;K=G或T;S=C或G;M=A或C;R=A 或G。 第2图显示吴郭鱼(Oreochromis mossambicus)IGF-I基因体DNA 的部份核酸序列。吴郭鱼IGF-I表现序列和5'端相 邻序列以大写字母表示;插入序列以小写字母表示 。#表停止密码子;*表起始密码子。序列下方之箭 头计号表示以PCR构筑为进行氯霉素乙醯转移(CAT )短暂转殖表现分析所需的引子。5'-RACE(5'端点的 快速放大)的区域之端点以箭头标志在序列的上方 注明5'-RACE。 第3图显示吴郭鱼(Oreochromis mossambicus)IGF-II基因起 动子区域的部份核酸序列。序列下方之箭头表 示以PCR方式构筑为进行氯霉素乙醯转移(CAT)分 析所需之引子。cDNA 5'端点的区域以5'-RACE(5'端点 的快速放大)决定并且以箭显示出。表现序列及5' 端相邻序列以大写字母表示;插入序列以小写字母 表示。转译起始密码子划底线并注明之。 第4图显示吴郭鱼(Oreochromis mossambicus)IGF-I和IGF-II基 因的5'相邻区域之起动子活性。将包含5'相邻区域 的片断的IGF-I-CAT结合质体转入人类大细胞肺癌细 胞中,48小时后测定CAT的活性値,所有实验是三次实 验値。CAT相对活性値(平均値标准偏差)是与不含 起动子的质体pCAT基本载体的转殖株相对比较而来 ,此定义为1.0。 第5图显示短暂转入(a)一IGF-I起动子,及(b)一IGF-II起 动子于人类大细胞肺癌细胞。这些起动子与pEGFP-1 载体连接并表现GFP。萤光影像(左)和明视野照片( 右)。 第6图显示一个IGF-I起动子-绿色萤光蛋白质(GFP)载 体经显微注射到斑马鱼2-细胞期受精卵。在培养 皿淡水中发育24小时后,最先在主干及头部见到GFP 的表现。然而在相同时期的其他胚胎注射IGF-I起 动子-GFP载体并无GFP的表现。明视野相片(下方)和 萤光影像(上方),所有相片皆以Olympus显微镜IX70之45 X镜头得之。 第7图显示IGF-II起动子-GFP载体经显微注射到斑马 鱼2-细胞期受精卵。萤光(下方)和明视野(上方)相 片。最先可看见GFP表现是在8小时(75%外包、原肠 期)(A)。影像是使用Olympus显微镜IX70.100X镜头得之 。IGF-II-起动子-GFP载体由一胚胎至下一胚胎阶段 和由1-期到下一期有很高的表现(B)(长方形图片C是 注射后24小时,长方形图片D是注射后48小时)。上述 长方形图片D显示太多于未经注射。绿色萤光集中 在卵黄、卵黄囊、卵黄囊外延和脊索(D)。显微注 射48小时后可在水平横肌隔(E)、眼睛(F)以及底板(G )观察到GFP的表现。 图8显示不同期斑马鱼(Brachydanio rerio)GFP cDNA的测定 (IGF-I:1-5道;IGF-II:6-9道)。讯息核醣核酸(mRNA)利用反 转录-聚合链反应(RT-PCR)产生GFP cDNA。萃取完 整胚胎和幼吴郭鱼全部RNA,经由RT-PCR和南方杂交法 分析。上图为使用GFP-专一性引子(如图1显示的GFP 1和GFP 2)得到RT-PCR产物,经由溴化物染色(Ethidium bromide staining)。下图指示使用磷32标定之GFP全长 cDNA探针进行南方杂交法分析。M-道是X174/Hae III 标准记号,1.6道:32-细胞期;2.7道:1-K-细胞期;3.8道:30% 外包期;4-道:原肠期;5-道:1-星期大鱼;9-道:2-星期大 鱼。 |
