| 主权项 |
1.一种突变之人类生长激素蛋白质,其特征为野生 型之胺基酸序列之第77位置的精胺酸被半胱胺酸 取代,具有如下所示之胺基酸序列:2.一种编码如申 请专利范围第1项之胺基酸序列的DNA,具有如下所 示之硷基序列:3.如申请专利范围第1项之突变之人 类生长激素蛋白质,其特征在于该突变之人类生长 激素蛋白质对生长激素受体蛋白质具有较强之亲 和力,同时亦具有降低之生长激素活性者。4.如申 请专利范围第1项之突变之人类生长激素蛋白质, 其中第53位置之半胱胺酸系被精胺酸取代。5.如申 请专利范围第1项之突变之人类生长激素蛋白质, 其中第165位置的半胱胺酸系被精胺酸取代。6.一 种如申请专利范围第1项之蛋白质的胜,其特征 为该胜系构成该蛋白质与受体蛋白质之结合位 置者,以及一种编码如下所示该胜之胺基酸序列 :7.如申请专利范围第2项之DNA,其配置于一质体中 之一启动子的下游,并以该质体转型复数个有机体 细胞,再由该些有机体细胞产生一产物。8.如申请 专利范围第1.4.5或6项之突变之人类生长激素蛋白 质,其系作为一医药之一活性成分,而该医药系用 为治疗巨大畸形症或先端肥大症。9.如申请专利 范围第2项之DNA,其系作为一基因治疗用之医药。 图式简单说明: 第1图为实例1中所得突变之生长激素之胺基酸序 列(77-位置:R→C)及编码其蛋白质之硷基序列。 第2图为实例1所得之具有经取代进行突变之突变 生长激素的胺基酸序列(53位置:C→A)及编码其蛋白 质的硷基序列。 第3图为实例1所得之具有经由取代进行突变之突 变生长激素的胺基酸序列(165位置:C→A)及编码其 蛋白质的硷基序列。 第4a图为突变生长激素之基因结构,及PCR增幅用引 子之设计;5个表现序列(exxon)以框罩(box)表示,而PCR 引子以箭头表示; 第4b图为突变生长激素之DNA序列的照相图,其中指 出密码子77处精胺酸转为半胱胺酸的变异,系藉PCR 之使用,对基因组之DNA与RNA进行直接序列分析而予 以测定者。 第5图为使用下列所示审核酸序列为引子而构筑 位于53或165位置之半胱胺酸变更为丙胺酸之cDNA的 流程图: 引子f1:5'ACAGAAACAGG TGGGGGCAA3' R2:5'AATAGACTCTGAGAA AGCGGGG3' R3:5'GTCCATGTCCTTCCTGA AGGCGTAGAG3' PCR增幅系使用引子f1及R2进行位置53之突变(C→A), 及使用引子f1及R3进行位置165之突变(C→A)。另外, 以限制HinfI及NlaIII切割正常生长激素之cDNA以制 备正常生长激素cDNA之部分下游,接着以接合连 接PCR产物。 第6图为血清中突变型和野生型生长激素之等电聚 焦(IFE)之分析图。将血清样本(150至300l)于1%HPMC-4 %两性电解质(Ampholine)(pH3.5- 8.0)中进行等电聚焦分析,将其作区分(fraction)收集, 并分析生长激素的活性(■),IEF形成之pH梯度以(◆) 表示。推测经胱胺酸取代精胺酸造成的突变引起 约pH0.16之等电度降低。野生型与突变型生长激素 的波峰分别以白色及黑色箭头表示。图中,a:实证 组(proband)(病患:男孩);b:父亲。 第7a图为显示野生型及突变之生长激素如何抑制[ 125I]标记之人类生长激素结合至IM-9细胞之图。 制备最终浓度为1-3107个/ml的细胞(IM-9),添加不同 浓度之野生型及突变之生长激素[使用0.8ng/ml之[125 I]标记的人类生长激素(杜邦,美国)(0.33Ci/ml)],溶 液总体积为250l于30℃培养4小时后收集细胞,洗 涤并分析结合于细胞之放射活性。 第7b图为显示[125I]标记之人类生长激素对生长激 素结合蛋白质之结合力的抑制作用图。 将[125I]标记之人类生长激素(0.6Ci/ml)、重组体人 类生长激素结合蛋白质(0.6nM)及抗生长激素受体之 老鼠选殖之抗体(Mab263;AGEN,澳大利亚)(1:100,000)于4℃培 育16小时,同时分别增加野生型及突变之生长激素 的浓度,接着添加10%抗老鼠IgG(山羊)抗体(50l)、1% 正常的老鼠血清(50 l)及5%PEG(300l)。将反应溶液于4℃继续培育4小 时,离心,以伽玛()计数器分析沉淀物(丸粒)之放 射活性,结果以三次测定之平均値表示。 第8a图为IM-9细胞中之酪胺酸磷酸化作用的电泳图 照片,显示该作用决定于野生型及突变之生长激素 。 IM-9细胞各于含或不含100ng/ml人类生长激素(行1及2) 中,或于野生型生长激素(行3:10ng/ml,行4:100ng/ml)、 突变之生长激素(行5:10ng/ml,行6:100ng/ml)及10ng/ml固 定浓度的突变之生长激素与渐增浓度之野生型生 长激素(行7:10ng/ml;行8:25ng/ml;行9:50ng/ml;行10:100ng/ml) 存在下,于37℃处理1小时。此等细胞之清洁剂溶解 液以磷酸化酪胺酸之专一抗体予以免疫沉淀,并藉 西方墨迹法,以相同抗体结合至山葵过氧化而予 以分析。以千道耳吞(Kilo-Dalton)为单位之分子量标 示于左缘。 箭号处代表由生长激素作用所产生之酪胺酸磷酸 化之蛋白质带。 第8b图为显示针对P120之抗磷酸化酪胺酸免疫墨迹 法施行浓度计量法分析之条状图。 以浓度计量法测定酪胺酸磷酸化之P-120(报告为JAK2 之IM-9细胞)的量。浓度计量法之强度系以相对于 作为对照组之不经生长激素处理者所得値表示。 所示者为自三个独立实验所得实测値之平均値[ 标准误差(SEM)]表示,并以史特邓代(Student)t-试验进 行统计分析。 |
