融合蛋白催化顺序酶反应的方法

摘要

本发明公开了一种融合蛋白催化顺序酶反应(又称为偶联酶反应)的方法。其步骤是通过体外基因拼接构建并表达“酶－连接肽－酶”双催化活性融合蛋白,获得融合蛋白纯品,比较分析融合蛋白的催化动力学性质。连接肽的作用是增加两酶之间的分子距离,减小它们的空间位阻,使融合蛋白最大限度地保持其原有生物学活性。融合蛋白同时具有两种酶的催化活性,在顺序酶传感器和酶反应器制备中实现了顺序作用酶控制的共固定化,从而有效提高顺序酶反应的反应速率。该方法是解决顺序酶反应低效率问题的一种新的模式方法,适合于制作高质量顺序酶传感器和固定化酶反应器。

主权项

1.一种融合蛋白催化顺序酶反应的方法，包括下列步骤：A、融合基因的构建，通过基因操纵，将固定的酶(1)编码基因、连接肽编码序列和酶(2)编码基因依次拼接，构建酶-连接肽-酶融合基因，并将其克隆到表达载体上，该融合基因编码的融合蛋白的一级结构为：酶(1)或(2)-[(甘氨酸-丝氨酸)n]-酶(2)或(1)，其中10≥n≥3；B、融合基因的表达，将携带融合基因的质粒转化到合适的受体细胞，从选择性平板上随机挑选转化子，通过PCR分析鉴定阳性转化子，在液体培养基中表达出融合蛋白：C、融合蛋白的制备，离心培养液，胞外酶收集上清液，胞内酶收集细胞，提取粗蛋白，然后分离、纯化融合蛋白，纯化后的蛋白液浓缩后于4℃保存；D、融合蛋白的鉴定，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳验证融合蛋白的纯度后，用光吸收法或蛋白质浓度测定试剂盒来测定样品中的融合蛋白浓度；E、融合蛋白酶活力检测及催化动力学性质分析，分别对酶(1)和酶(2)混合物及融合蛋白进行酶动力学性质分析，确定酶催化动力学常数，比较融合蛋白与游离酶的催化动力学性质；F、融合蛋白的固定，选择介质和固定化方法对融合蛋白及酶(1)和酶(2)混合物进行固定，比较固定后融合蛋白与酶(1)和酶(2)混合物的顺序催化活力；G、融合蛋白顺序酶传感器和固定化酶反应器的制备及特性鉴定，通过对实际样品的操作，对融合蛋白顺序酶传感器和固定化酶反应器与传统顺序酶传感器和固定化酶反应器进行比较分析。