修饰的胶原诱导血小板凝集抑制剂Pallidipin的制备方法

摘要

本发明提供一种称为Asp－Pallidipin的重组蛋白的制备方法。Asp－Pallidipin抑制哺乳动物血小板由胶原诱导的凝集。该Asp－Pallidipin包括：（i）选自Pallidipin蛋白群的一种蛋白（Pallidipin），和（ii）天冬氨酸，其中天冬氨酸通过肽键与Pallidipin的Ｎ－末端相连。该方法包括aa）用适当载体转染至少一种细菌，该载体包含：i）编码重组Asp－Pallidipin的ＤＮＡ或cＤＮＡ，ii）适当的信号肽序列，该信号序列被切除后从Pallidipin的位置看天冬氨酸位于氨基酸序列和＋１位，和iii）适当的启动子；bb）表达包括Asp－Pallidipin和信号序列的前蛋白；cc）Asp－Pallidipin从细菌胞质转运至周质，在转运过程中前蛋白被至少一种蛋白酶裂解，产生Asp－Pallidipin，dd）提取周质分离Asp－Pallidipin，和ee）纯化Asp－Pallidipin。这种蛋白用作抑制由脱原诱导的人血小板凝集或抑制有转移肿性瘤细胞之癌的药物。

主权项

1．一种重组Asp-Pallidipin的制备方法，其中该Asp-Pallidipin抑制哺乳动物血小板的胶原诱导凝集，该Asp-Pallidipin包含：(ⅰ)选自Pallidipin蛋白群的一种蛋白，和(ⅱ)天冬氨酸，其中天冬氨酸通过肽键与Pallidipin的N-末端连接；从而Asp-Pallidipin具有下列氨基酸序列：a)以下序列表中所示序列 aa)SEQ ID NO:1； bb)SEQ ID NO:2或 (c)SEQ ID NO:3；或b)SEQ ID NO:1-3中任何序列的等位变体或突变蛋白，该等位变体或突变蛋白具有成熟Asp-Pallidipin的活性，但排除那些在Pallidipin N-末端没有肽键连接的天冬氨酸的序列，或c)进行了翻译后修饰的SEQ ID NO:1-3中任一蛋白或b)中所述其变体或突变蛋白，该修饰不影响成熟蛋白的活性；该方法包括以下步骤：aa)用适当载体转染至少一种细菌，该载体包含有效连接的：(ⅰ)编码重组Asp-Pallidipin的第一DNA或cDNA分子，(ⅱ)编码适当的信号肽序列的第二DNA分子，和(ⅲ)适当的启动子；且表达并转运至周质时包括信号肽和Asp-Pallidipin的前蛋白被裂解，使天冬氨酸处于成熟Asp-Pallidipin氨基酸序列的+1位，bb)表达包括Asp-Pallidipin和信号肽序列的前蛋白；cc)Asp-Pallidipin从细菌胞质转运至周质，在转运过程中前蛋白被至少一种蛋白酶裂解，产生成熟的Asp-Pallidipin，dd)提取周质分离Asp-Pallidipin，和ee)纯化Asp-Pallidipin。