铁氧还蛋白的简易分离方法

摘要

本发明涉及一种植物铁氧还蛋白的简易分离方法。铁氧还蛋白是普遍存在于植物体内的一种低分子量具有氧化还原性质的蛋白,它参与光合作用和生物固氮等生理活动。是一种重要的生物化学试剂。传统的分离方法需耗用大量的丙酮,本发明提供一种省略丙酮的分离步骤,解决由于使用丙酮带来工艺上的困难。产品适用于对铁氧还蛋白纯度要求不是很高的生化反应,对于光合电子传递的离体实验,由于某些成分未被分离,反而有利反应进行。

主权项

1．一种铁氧还蛋白的简易分离方法(一)用菠菜叶预先深冻(-20℃)，室温下解冻，使细胞冻融破裂，加入Tris-HCI 0.01M pH7.3缓冲液，捣碎冻融叶片，纱布和尼龙布过滤，(二)滤液中加入深冷(-20℃)丙酮，使之浓度到35％丙酮。经5000×g离心，把沉淀弃去。在离心后的上层液中继续加入深冷丙酮，使之浓度达到75％静止后，使沉淀沉降，吸去部分上清液后，余留带有沉淀的75％浓度丙酮溶液，经5000×g离心，收集沉淀，用冷风吹干残留沉淀中的丙酮，并使悬浮于0.01 M Tris-HCI pH7.3缓冲液，对同样缓冲液透析，再经18000×g离心20分钟，红棕色的上层液为含Fd的粗制品，(三)在红棕色的样品中加入固体NaCl，使之成0.15MNaCl浓度，并把它吸附到预先经0.01M Tris-HCI pH7.3和0.15MNaCl平衡过的DEAE-纤维素(D-52)分离柱上，以同样的缓冲液洗柱，未被吸附的样品流弃，深棕红色的Fd吸附带呈现在分离柱的上端，再分次提高洗脱缓冲液中的NaCl浓度以0.2M、0.25M、0.3M……，同时观察分离柱的上端Fd移动的情况，直到提高NaCl浓度到棕红色吸附带开始下降移动，就不再提升NaCl浓度，继续洗脱，并收集出棕红色的Fd制剂，(四)将收集的Fd溶液，对不含NaCl的0.01M Tris-HCI透析脱盐，浓缩保存、备用，其特征在于省略了第二步，不再用35％～75％的丙酮分级沉淀，而直接用DEAE-纤维素吸附蛋白。