| 主权项 |
1.一种来自竹嵌纹病毒卫星核酸具有感染力之cDNA 质体,其中包含全部如下图所示之核酸序列,其 生体外转录体和BaMV基因体RNA共同接种时,可在寄 主植物中繁殖复制;上述cDNA质体可为pBSF4.pBSF5.pBSF6 .pBSF7或pBSF8之任一者。2.一种于植物体内快速表现 外来基因之方法,系利用如第1项所示之竹嵌纹病 毒卫星核酸为植物表现载体,其构筑系依照下列步 骤进行: a.制备全长具感染力的竹嵌纹病表卫星核酸cDNA:亦 即合成卫星核酸全长cDNA,并在其5'前端,如接适当 的启动子,选殖在适当的高复制质体,则其生体外 转录体(in vitro transcript)具有生物活性,能在BaMV基 因体RNA存在时,在感染的植物体内复制; b.制备含外来基因的卫星核酸重组体:将上述含卫 星核酸cDNA的转译区删除,于适当的限制间嵌入 外来基因,以生体外转录系统,制备含有外来基因 卫星核酸重组杂配转录体,在BaMV基因体RNA存在下 接种植物,外来基因卫星核酸重组转录体具有生物 活性,外来基因可在感染植物体表现。3.如申请专 利范围第2项之方法,以竹嵌纹病毒卫星核酸为载 体,有下列两项应用: a.以卫星核酸为植物表现载体,表现外来基因的功 能; b.以卫星核酸为植物表现载体,在植物体生产外来 基因产物,经采收其叶片,可以获得纯化之外来基 因产物。4.如申请专利范围第2项之方法,其中竹嵌 纹病毒包括各种不同分离株。5.如申请专利范围 第2项之方法,其中竹嵌纹病毒为RaMV-V。6.如申请专 利范围第2项之方法,其中竹嵌纹病毒为BaMV-O。7.如 申请专利范围第2项之方法,其中竹嵌纹病毒为BaMV- S。8.如申请专利范围第2项之方法,其中卫星核酸 包括来自不同竹嵌纹病毒分离株之卫星核酸。9. 如申请专利范围第2项之方法,其中全长卫星核酸 cDNA的前端,外接T7,SP6,或SP3。10.如申请专利范围第9 项之方法,所接启动子为T7启动子。11.如申请专利 范围第2项之方法,其中质体为pUC119。12.如申请专 利范围第2项之方法,其中限制为BstXI和EcoNI。13. 如申请专利范围第2项之方法,其中接种植株系选 用任何之双子叶植物寄主。14.如申请专利范围第2 项之方法,其中接种植株系选用任何之单子叶植物 寄主。图式简单说明: 第一图病毒RNA之电泳图(A)及北方杂配分析(B,C)。 (A)纯化之病毒RNA(1)胡瓜嵌纹病毒(CMV)RNA。(2)绿竹 嵌纹病毒(BaMV-O)RNA。(3)泰山竹嵌纹病毒(BaMV-V)RNA在 1%非变性洋菜胶体之电泳图,电泳以Tris-硼酸盐缓 冲溶液进行,而以二铯溴(ethidium bromide)染色。 (B,C)病毒RNA在电泳中分离后,转印到H-Bornd之杂配膜 上,分别以L-cDNA探针(B)和S-cDNA探针(C)杂配。L-cDNA和 S-cDNA探针之制备,系分别以L RNA或satBaMV RNA为模版, 在鸟类髓母细胞血症病毒(avian myeloblastosis virus)反 转录(Promega, Madison, WI)存在下,以任意之六个核 酸或由寡d(T)15引子导引而合成之32p标识之cDNA。 第二图北方杂配分析病毒RNA于大麦原生质体之复 制情形。 原生质体分别接种(1)BaMV-V RNA。(2)BaMV-L RNA。(3) satBaMV RNA。(4)BaMV-L与satBaMV之混合RNA。(5)蒸馏水。( 6)纯化之BaMV-V RNA为分子标志。接种的原生质体培 育24小时后,抽取全部核酸,电泳,转印到H-Bond杂配 膜上分别以(A)L-和S-混和之cDNA探针。(B)L-cDNA探针 。(C)S-cDNA探针侦测。L-cDNA和S-cDNA探针之制备如第 一图所述。RNA大小以Kb表示,箭头标示satBaMV RNA。 第三图泰山竹嵌纹病毒分离株之satBaMV全长之cDNA 核酸序列及其胺基酸序列。 第四图病毒RNA于兔子网状红血球胞裂解液(RRL)之 转译产物,于8-20%线性梯度十二烷硫酸钠之聚丙烯 胺胶体(SDS-polyacrylamide)电泳系统进行分析。(1)BaMV- O RNA。(2)BaMV-V RNA。(3)从胶体纯化之satBaMV。(4)BaMV-L RNA。(5)蒸馏水。分子量标志标于第行之左侧,以 kDa为单位。 第五图北方杂配分析satBaMV转录体在大麦原生质体 的复制能力。原生质体接种(1)BaMV-L RNA。(2)BaMV-L RNA及自然界分离之satBaMV。(3)BaMV-L RNA及BSF4转录本 。接种24小时后,抽取全部RNA,再glycoxy-lated,取3104 原生质体之RNA量于1%洋菜胶体进行电泳,转印到尼 龙膜,以32P标记之(A)BaMV第一转译区探针及(B)S探针, 进行杂配。BaMV第一转译区探针为基因体RNA专一性 探针,由pORF1之T7 RNA聚合脢转录体产生,而pORF1是由 pBaBL2之EcoRI/HincII片段(J. Gen. Virol. 75:2513-2518, 1994) 选殖入转录载体pGEM4(Promega)。S探针为satBaMV的专一 性探针,为一互补于satRaMV 3'端822核酸之cDNA株之T 7 RNA聚合转录体。 第六图satBaMV突变种构筑及其活性分析。 (A)satBaMV突变株其编码架构的改变及其在大麦原生 质体与白藜植株之复制能力。空白区域代表satBaMV 非转译序列,而单线对应于所删除之序列,黑色区 域代表satBaMV转译区域,灰色区域代表转译区域已 改变编译架构。 (B)satBaMV各种突变体在感染的原生质体中的累积量 。如图上方所示,大麦原生质体共同接种BaMIV-L RNA 及各种satBaMV突变株,8,16及24小时后,分别抽取来自3 104大麦原生质体之全部RNA,以S探针进行北方杂配 分析。单独F4,代表仅接种BSF4转录体。 第七图satBaMV突变体子代RNA之反转录PCR产物。白藜 叶片共同接种BaMV-L RNA及satBaMV突变体,七天后抽取 全部RNA,以引子BSO及BS23进行反转录PCR产物扩大,进 行胶体电泳分析。反转录PCR产物以1%洋菜胶电泳 分离后,以乙铯溴染色。第1行大小标记以Kb表示, 第2-7行为分别抽取来自共同接种BaMV-L RNA及BSF4, BSFS, BSF6, BSF7, BSF8,或BSF9之叶片之反转录PCR产物。 第八图PCR产物序列分析共同接种BaMV-L RNA及satBaMV 突变种的白藜叶片中之子代卫星核酸。 第九图卫星核酸杂配体BSCAT之构筑、胶体电泳、 北方杂配分析及其CAT蛋白表现于共同接种BaMV-L RNA 之白藜叶片之含量。 (A)野生型pBSF4及pBSCAT杂配体之结构,淡灰区域代表 BSF4转译编码区域而暗色区域代表CAT编码区域。 (B)白藜叶片单独接种BaMV-L RNA(第1行),或混合接种 BSF4(第2行)或BSCAT(第3行),或蒸馏水为模拟对照组( 第4行)。每一行之病毒RNA来自0.2g之接种叶,以1% 洋菜胶电泳分析并以乙铯溴染色。 (C)将图中(B)之病毒RNA样本,转印至尼龙膜,进行北 方杂配,S探针与第五图所使用的相同,但是以EcoNI 直线化之生体外转录体杂配。 (D,E)BaMV鞘蛋白(D)及CAT蛋白(E)在接种白藜叶片之累 积量。白藜叶片单独接种BaMV-L RNA或BSCAT转录体或 混合接种BaMV-L RNA和BSCAT转录体,3,6,9天接种后,抽取 全部蛋白,以ELISA侦测上述两种蛋白含量。结果以 meansSEM代表三个独立实验。 第十图北方杂配分析BSF4转录体以不同BaMV分离株 之基因体RNA为协助病毒在大麦原生质体的复制。 大麦原生质体分别单独接种(1)BaMV-O RNA(3)BaMV-L RNA 和(5)BaMV-S RNA以及分别和BSF4生体外转录体之混合 物(2,4,6)。接种24小时后,抽取全部RNA,行北方杂配, 分别以L-cDNA和S-cDNA侦测。而其探针之制备,如第一 图所述,箭头指示satBaMV的位置。 第十一图含有竹嵌纹病毒卫星核酸基因之质体( pBSF4)图谱,外来基因可插入BstXI和EcoNI两限制之 间。 |
