| 主权项 |
1.一种单聚乙二醇化巨核细胞生长发育(NGDF)多, 其具有下示胺基酸序列(图11)中第 22-184个之胺基酸且聚乙二醇基团系连接于该多 之N端:2.根据申请专利范围第1项之单聚乙二醇化 MGDF多,其中该聚乙二醇基具有2至100千道耳 顿的平均分子量。3.根据申请专利范围第1或2项之 单聚乙二醇化MGDF多,其中多部份系已于大肠 杆菌中生 产者。图式简单说明: 第一图所示为巨核细胞和血小板的发育和成熟化 之综览。 第二图所示为可溶性老鼠Mpl受体实质地完全抑制 受照射狗血浆("再生不能性犬血浆"或 "APK9")诱导巨核细胞发育之能力。巨核细胞发育的 分析述于实施例2中。 第三图所示为APK9经外源拟集素和Hpl受体两种亲和 层析术程序增强的活性("Mpl配体") 剌激1A6.1细胞的生长及可溶性老鼠Hpl受体阻断该 生长之情形。 第四图所示为从再生不能性犬血浆纯化25和31 kd两 形式的犬Mpl受体所包含的纯化步骤 总览。 第五图所示为用逆相HPLC(RP-HPLC)纯化Mpl配体。洗提 份21含有高度纯化的31 kd Mpl 配体;洗提份22含有31 kd和25 kd两种Hpl配体的混合物 ;而洗提份23含有高度纯化的25 kd Mpl配体。 第六图所示为含有25及/或3 1kd两种Mpl配体蛋白质 的逆相HPLC(C4管柱)洗提份中之 Mpl配体活性的比较。 第七图所示为经CD34-选择过的周围血液细胞培养 物用APK9,Mpl配体和各种其他因子予 以刺激所产生的巨核细胞之数目。 第八图所示为经CD34-选择过的周围血液细胞培养 物用APK9,Hpl配体和各种其他因子予 以刺激而产生的总白血球数目。 第九图所示为经CD34-选择过的周围血液细胞培养 物用APK9,Hpl配体和各种其他因子予 以刺激而产生的巨核细胞百分比。 第十图所示为未参与在Hpl-配体-诱导巨核细胞发 育中的人类IL-3。 第十一图所示为cDNA和推演所得人类MGDF-1和MGDF-2的 胺基酸顺序。 第十二图所示为cDNA和推演所得人类MGDF-3的胺基酸 顺序。 第十三图所示为MGDF-1与得自犬源(A)和老鼠源(B)的 MGDFs(Mpl配体)之间的比较。 第十四图所示为用一甲氧基-聚乙二醇的N-羟基丁 二醯亚胺基(NHS)活性酯将MGDF醯化 导到聚乙二醇化产物之实施例。 第十五图所示为用一甲氧基-聚乙二醇醛进行非特 定性MGDF退原性烷基化得到多聚乙二 醇化产物之例子。 第十六图所示为用一甲氧基-聚乙二醇醛在N-端残 基的-胺基进行部位特定性MDF还原 性烷基化导致实质的单聚乙二醇化产物之实例。 第十七图所示为用MW 20kDa MePEG活化衍生物制得的 MePEG-MGDF结合物之粒度排外 (SEC)HPLC分析结果; A.用MePEG(PM11)的NHS酯将MGDF醯化制成的多-MePEG-MGDF- 结合物; B.用MeMG醛(PM 20)将MGDF烷基化制成的多-HePEG-MGDF-结 合物; C.用MePEG醛(PEG 16)将MGDF烷基化制成的单-MePEG-HGDF-结 合物。 第十八图所示为用重组人类MGDF处理小鼠后的血小 板计数之空心菱形=CHO-衍生22-353 MGDF;空心圆=未聚乙二醇化的大肠杆苗22-184 MGDF(亦 即,1-163 MGDF);及空心圆=聚乙 二醇化的大肠杆菌22-184 MGDF。 第十九图所示为-HuMGDF的纯化流程图。 第二十图所示为在老鼠Carboplatin模型中-HuMGDF(大 肠杆菌1-163)对血小板计数的 影响,于第0日时,用单剂的Carboplatin(1.25毫克/小鼠 经腹膜内注射Balb/c小鼠。只有 赋形剂的组则不加Carboplatin。于24小时后,于研究 的其余天数内每天用赋形剂或100 g/kg -HuMGDF经皮下注射经Carboplatin-处理的动物。( 每一组,n=10;于每隔一时点, 将5只动物放血)。 第二十一图所示为-HuHGDF的(大肠杆菌1-163)对于 经照射处理过的小鼠所具血小板计 数的影响。在第0天用500雷得-辐射(锶源)单剂量 照射Balb/c小鼠。只含赋形剂的组未受 照射。于24小时后,在其余的研究天数内每天用赋 形剂或100 g/kg -HuHGDF经皮下注射 受照射动物(每一组,n=8;于每隔一时点时将4只动物 放血)。 第二十二图所示为-HuMGDF的(大肠杆菌1-163)对于 经照射和Carboplatin组合处理过 的小鼠所具血小板计数之影响。于第0天时,用500 雷得-辐射(锶源)照射Balb/c小鼠并给 用Carboplatin(1.25毫克/小鼠)于24小时后.在其余研究 天数中每天用赋形剂或100 g/kg -HuHGDF经皮下注射试验动物(每组n=8)。没有 -HuHGDF的支 时,大部份的动物在 此研究中都不能残存。于对照组中,8只动物中有1 只残存。于处理组中,8只动物中8只都存 活。 第二十三图所示为-HuMGDF的(大肠杆菌1-163)对于 恒河猴照射诱导血小板减少症之影 响。使恒河猴接受照射(700 cGy Co-80)。于照射后24 小时起的18连续天中,经皮下给用 -HuMODF(n=3)或人类血清白蛋白(n=9)(各为25微克/公斤/ 天)。用电子血球分析仪进行血 球分析。每一符号代表平均値(+/-sem)。 第二十四图所示为经聚乙二醇化与糖化的- HuMGDF对于经Carboplatin和照射等处理 过的小鼠所具血小板计数之影响。依第二十二图 进行的研究所述对小鼠施以Carboplatin和 照射之组合处理。于处理后24小时开始的天数中, 每天经皮下注射所示-HuHGDF制剂(50微 克/公斤/天)。用电子血球计数器(Sysmex,Baxter)于所 示天进行血球计数。 第二十五图所示为具有大肠杆菌最适化密码子的 重组人类MGDF,胺基酸1-163之合成基 因序列。 |
