人源含硒抗体酶的制备方法

摘要

本发明属于人源含硒抗体酶的制备方法。本发明利用S－二硝基苯取代的谷胱甘肽二酯作为半抗原,从人源噬菌体展示的单链抗体库中筛选得到半抗原特异的单链抗体,化学修饰在大肠杆菌中利用突变引物高效表达的特异抗体,将催化基团引入到抗体的活性部位,成功获得了具有谷胱甘肽过氧化物酶活力的人源含硒抗体酶。本发明提供的人源含硒抗体酶制备方法具有技术先进,产量高,成本低的特点,有明显的临床应用潜力。

主权项

1.一种人源含硒抗体酶的制备方法，其特征在于具体制备步 骤有以下四步： I.半抗原的设计与合成 系列半抗原结构如下：R＝-C₄H₉，-C₆H₁₁，-CH₂(C₆H₅)，-CH(CH₃)₂，-CH₂CH₂CH(CH₃)₂取0.8-1.2g谷胱甘肽与2，4-二硝基氯苯在10℃反应，得到S- 二硝基苯取代的谷胱甘肽，将0.1-0.5gS-二硝基苯取代的谷胱甘 肽加入2-5ml相应的醇：正丁醇或异丙醇或苄醇或正己醇或异戊醇， 冰浴，通入过量的干燥氯化氢至饱和，在4-20℃放置5-80hr，反 应结束后，产物用乙醚洗涤，干燥，即为系列半抗原S-二硝基苯取 代的谷胱甘肽二酯； II.半抗原特异的人单链抗体基因的筛选 用10-40μg/ml半抗原包被免疫平皿，加入人噬菌体展示的单链 抗体库，15-37℃温浴2hr，0.05M，PH7.2的磷酸钠缓冲液洗平皿， 加入0.5-2.5ml，20-150mmol/L的三乙胺，20-40℃放置8-15min， 用0.4-1.0ml，0.5-1.2mol/L，PH7.0-8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸 盐溶液中和洗脱液，洗脱下的噬菌体加入到OD值为0.2-1.0的5-15ml 的大肠杆菌TG1中，于20-40℃侵染25-40min，在含100μg/ml的氨 苄青霉素和1％的葡萄糖的2×TY中扩大培养TG1，利用野生的噬菌 体M13K07捕获特异噬菌体，重复以上过程3-6次，酶联免疫法检测 筛选得到的特异噬菌体抗体； III.人原单链抗体的高效表达、复性及纯化 提取特异抗体基因，测序，在保持氨基酸序列不变的前提下， 根据基因序列设计突变引物，扩增抗体基因，利用NdeI/HindIII酶 切位点将抗体基因组装到pET21a表达载体上，获得了以包含体形式 高效表达的单链抗体，将从1L培养物中收获的菌体重悬于PH8.0， 含有2mMβ-巯基乙醇和0.01％溶菌酶的50mM三羟甲基氨基甲烷盐 酸盐溶液中，超声破碎菌体，12000rpm离心20分钟，沉淀即为包 含体，包含体经2M氯化钠溶液，0.5％TritonX-100和4M尿素洗涤 后，溶于3-12ml，含6M盐酸胍，PH为7.0-9.0，10-50mM三羟甲 基氨基甲烷盐酸盐变性液中，用BIO-RAD公司的蛋白检测试剂盒测 定蛋白浓度，在50ml含0.2-1.0M精氨酸，1-5mM乙二胺四乙酸，1-3M 盐酸胍的0.1-0.8M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐复性液中滴加变性蛋白 溶液，每隔0.5-2.5hr滴加一次，共滴加3-8次，0-12℃放置过夜， 浓缩、透析除去盐酸胍，冻干，冻干的蛋白干粉溶于PH7.0-9.0， 10--50mM的磷酸钠缓冲液中，经葡聚糖凝胶SephadexG-75分离纯 化，收集主峰，即为单链抗体纯品； IV.催化基团的引入 把0.4-1.2×10^-5mmol/L单链抗体纯品，溶于无氧水中，加入 2.0-5.0×10^-5mmol/L苯甲基磺酰氟，15-30℃振荡1-3hr，在氮气 保护下加入0.5-2.5×10^-4mol/L硒氢化钠溶液，30-40℃保温25- 40hr，反应液经葡聚糖凝胶SephadexG-10除盐后，即得具有谷胱 甘肽过氧化物酶活力的人源抗体酶。