一种重组纳豆激酶的制备方法

摘要

纳豆激酶是一种安全,高效的具有纤溶活性的酶制剂。目前已被深入研究,试图作为口服溶栓剂予以开发应用。我们利用基因工程的方法,表达出具有纤溶活性的纳豆激酶。重组产物和天然纳豆激酶相比,具有良好的生物学活性。体内和体外实验证明,纳豆激酶具有良好的溶解血栓作用和促进内源性t－PA的产生,从而直接和间接的促进了溶栓作用。同时由于纳豆激酶的安全性较高,没有出现大出血等现象,易于口服治疗。

主权项

1.一种制备重组纳豆激酶(Nattokinase，本说明书中简称NK)的方法。包括纳豆激酶基因克隆的构建，在大肠杆菌中的表达及产物的纯化，生物活性的鉴定。其物征在于：(1)以Bacillus subtilis natto(As1.1086)菌体总DNA为模板，参考Subtilis(EC3.4.21.62)NAT基因序列设计引物，通过PCR方法直接扩增NK基因。NK基因克隆进pGEM-T载体后，经序列分析证实，然后与含有cIta857基因，PrPL启动子以及rmB基因转录终止信号的原核表达载体pBV220质粒组装成高效表达载体pBV-NK。(2)pBV-NK转化大肠杆菌BL21(DE3)，用温度诱导重组NK基因(r-NK)的表达，表达产物以包涵体的形式存在于工程菌中。(3)通过发酵技术大规模培养工程菌，用温度诱导基因表达，发酵参数为温度28-40℃，氧容量为50％-80％，pH6-8。(4)发酵后用高压破碎细菌，离心收集破碎后的沉淀。将包涵体变性后，经凝胶过滤纯化包含体。包含体复性后，经离子交换法纯化r-NK。进行活性测定后，冻干成粉末保存。