| 主权项 |
1.一种EB病毒核抗原-1(EBNA-1)蛋白质片段,其具如下 所示之胺基酸序列 。2.一种如下示之DNA序列,其可编码EB病毒核抗原-1 蛋白质片段 及其简并序列。3.根据申请专利范围第1项之蛋白 质片段,其系由根据申请专利范围第2项之DNA序列 所编码。4.一种制备根据申请专利范围第1项之蛋 白质片段之方法,其包括: (a)制备根据申请专利范围第2项之DNA序列, (b)将该DNA序列嵌入适于转形大肠杆菌宿主细胞之 表现载体中, (c)以该载体转形适当之大肠杆菌细胞,并 (d)于适合该宿主细胞表现该DNA序列之条件下培养 该宿主细胞,且回收所表现之蛋白质。5.根据申请 专利范围第4项之方法,其中之表现系统为大肠杆 菌表现系统。6.根据申请专利范围第4项之方法,系 将根据申请专利范围第2项之DNA序列嵌入大肠杆菌 表现系统上,且该基因系嵌入大肠杆菌转录起动子 之下游。7.根据申请专利范围第6项之方法,系将根 据申请专利范围第2项之DNA序列嵌入含有T7转录起 动子之大肠杆菌表现载体上。8.根据申请专利范 围第7项之方法,系以该含有T7转录起动子及根据申 请专利范围第2项之DNA序列之载体转形含有T7 RNA聚 合基因之大肠杆菌。9.根据申请专利范围第4项 之方法,其包含如下步骤: (a)将根据申请专利范围第2项之DNA序列嵌入含有T7 转录起动子之表现载体中, (b)以该含有T7转录起动子及根据申请专利范围第2 项之DNA序列之载体转形含有T7 RNA聚合基因之宿 主, (c)将该宿主在适当温度培养至快速繁殖期,然后加 入化学诱导剂使T7 RNA聚合大量表现该EB病毒DNA, 而使得EB病毒核抗原-1蛋白质被大量制造, (d)再经培养;以及 (e)大量制造EB病毒核抗原-1蛋白质。10.一种用于检 验EB病毒相关疾病之检验试剂,其特征系包含根据 申请专利范围第1项之蛋白质片段。11.根据申请专 利范围第10项之检验试剂,其系用于检验鼻咽癌。 12.根据申请专利范围第10项之检验试剂,其系用于 检验巴基氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)。13.根据申请 专利范围第10项之检验试剂,其系用于检验感染性 单核血球症。14.根据申请专利范围第10项之检验 试剂,其系用于检验B细胞淋巴球增生症。15.一种 利用免疫分析法侦测抗EB病毒核抗原-1蛋白质抗原 特异性抗体之方法,其特征为使用至少一种由根据 申请专利范围第2项之DNA序列所编码之蛋白质,或 根据申请专利范围第1项之蛋白质。16.根据申请专 利范围第15项之方法,其包括: (a)提供至少一种由根据申请专利范围第2项之DNA序 列所编码之蛋白质,或根据申请专利范围第1项之 蛋白质, (b)提供一支持固相, (c)该蛋白质附于该支持固相上, (d)使附于支持固相上之该蛋白质于该支持固相上 与检品接触,而与检品中特异性抗体反应,形成结 合物;且 (e)提供一种标志有产生讯号作用之抗人类抗体,其 中该产生讯号之抗人类抗体与该结合物结合,因而 以所产生讯号检测该特异性抗体之量。17.根据申 请专利范围第16项之方法,其中产生讯号之工具是 选自过氧化,-半乳糖甘,及硷性磷酸所标 志者,或萤光标志及其它可检验之标志。18.根据申 请专利范围第17项之方法,其中产生讯号之工具是 硷性磷酸所标志者。19.根据申请专利范围第17 项之方法,其中产生讯号之工具是过氧化所标志 者。20.根据申请专利范围第17项之方法,其中产生 讯号之工具是-半乳糖所标志者。21.根据申 请专利范围第17项之方法,其中产生讯号之工具是 择自萤光标志者。22.一种侦测抗EB病毒核抗原-1蛋 白质特异性抗体之套组,其特征为包括 (a)一个支持固相, (b)一种附着于支持固相上之根据申请专利范围第1 项之蛋白质片段,该蛋白质片段可吸附该特异性抗 体,及 (c)一讯号产生系统,其包括一操作性结合有抗人类 抗体及产生可识别信号之酵素或萤光,因此当该蛋 白质,吸附该特异性抗体而与该讯号产生系统之抗 人类抗体结合时,可产生核心抗原-特异性抗体-抗 人类抗体萤光物质结合物,而由讯号产生系统所产 生之讯号侦测特异性抗体之量。23.根据申请专利 范围第22项之套组,其中该讯号产生系统之酵素系 选自过氧化,-半乳糖甘,及硷性磷酸所组 成之群体者。24.根据申请专利范围第23项之套组, 其中该讯号产生系统之酵素系过氧化。25.根据 申请专利范围第23项之套组,其中该讯号产生系统 之酵素系-半乳糖甘。26.根据申请专利范围第 23项之套组,其中该讯号产生系统之酵素系硷性磷 酸。27.根据申请专利范围第23项之套组,其中该 支持固相系利用生物检测器(biosenser)之一部分,而 讯号侦测系统系利用电子检测仪器。28.根据申请 专利范围第22项之套组,像用于鼻咽癌之检测。29. 根据申请专利范围第4项之方法,其包含: a)以pDB172表现载体转形大肠杆菌细胞,并 b)于适合大肠杆菌细胞表现该基因之条件下培养 该细胞,且回收所表现之蛋白质。30.根据申请专利 范围第29项之方法,其中大肠杆菌中含有T7 RNA聚合 基因。31.根据申请专利范围第29项之方法,其包 含如下步骤: (a)以pDB172表现载体转形含有T7 RNA聚合基因之大 肠杆菌, (b)将该宿主在适当温度培养至快速繁殖基,然后加 入化学诱导剂使T7 RNA聚合大量表现该EB病毒DNA, 而使得EB病毒核抗原-1蛋白质片段被大量制造, (c)再经培养;及 (d)大量制造EB病毒核抗原-1蛋白质片段。32.一种制 备完整之EB病毒核抗原-1蛋白质之方法,其包含: a)以pDB152表现载体转形大肠杆菌细胞,并 b)于适合大肠杆菌细胞表现该基因之条件下培养 该细胞,且回收所表现之蛋白质。33.根据申请专利 范围第32项之方法,其中大肠杆菌中含有T7 RNA聚合 基因。34.根据申请专利范围第32项之方法,其包 含如下步骤: (a)以pDB152表现载体转形含有T7 RNA聚合基因之大 肠杆菌, (b)将该宿主在适当温度培养至快速繁殖基,然后加 入化学诱导剂使T7 RNA聚合大量表现该EB病毒DNA, 而使得EB病毒核抗原-1蛋白质被大量制造, (c)再经培养;及 (d)大量制造EB病毒核抗原-1蛋白质。35.一种表现载 体,其系为pDB172及pDB152。36.一种大肠杆菌细胞,其 系经根据申请专利范围第35项之载体所转形。37. 根据申请专利范围第36项之大肠杆菌细胞,其系大 肠杆菌BL21(DE3)细胞。38.一种纯化重组表现之根据 申请专利范围第1项EB病毒核抗原-1蛋白质片段之 方法,其特征为使用硫酸铵沈淀浓缩菌体离心上清 液后,进行S-琼脂糖阳离子交换管柱层析,再以SDS- PAGE电泳纯化。图式简单说明: 第一图、EB病毒核抗原-1基因之完整核酸序列。 其中转译起始译码ATG及终止译码TGA系以粗体字表 示;划底线者为重复序列;斜粗体字表示者为重要 限制之切割位置;加框者为引子结合部位。 第二图、EB病毒核抗原-1蛋白质片段的胺基酸序列 (A)及其编码核酸序列(B)。 第三图、(A)质体pDB152之构筑简图。其中质体系以 直线形式表示,粗线表示EB病毒核抗原-1基因,及 分别为噬菌体T7基因10之起动子及转录终结子, 为 六个组胺酸,ApR为Ap抗药性基因,lacI为Lac起动子之 抑制子基因,A、B、E、N及S分别表示限制AccI、 BamHI、EcoRI、NdeI及SamI之切割位置; (B)聚合连锁反应所用之引子的核 酸序列。其中 括弧内为原先未经改变之核酸,蛋白质之起始译 码ATG系以斜体字表示。 第四图、大肠杆菌BL21(pDB152)菌体蛋白质用鼻咽癌 患者血清所做之西方墨渍(IgA)分析之结果。其中 之数字代表蛋白质分子量(Kda)之位置,To及Ta分别表 示经IPTG诱导前后之菌体蛋白质。箭头所指为EB病 毒核抗原-1蛋白质之位置。 第五图、大肠杆菌BL21(pDB152)菌体蛋白质利用肝素- CL-4B管柱层析后以SDS-PAGE分析之结果。其中之数字 代表蛋白质分子量(Kda)之位置,Con为对照组,仅含纯 化后分子量为67Kd之EB病毒腺核激(TK)及分子量 为42Kd之EB病毒复制活动子蛋白质(ZEBRA);To及Ta分别 表示经IPTG诱导前后之菌体蛋白质;FT及Elute分别表 示肝素-CL-4B管柱层析流出菌体蛋白质及以0.1M NaCl 析出之菌体蛋白质。箭头所指为EB病毒核抗原-1蛋 白质之位置。 第六图、大肠杆菌BL21(pDB152)(DE3)菌体蛋白质利用 肝素-琼脂糖-CL-4B管柱层析后之EB病毒核抗原-1蛋 白质,利用鼻咽癌患者与正常人血清所做西方墨渍 (IgA)之分析结果。其中右边之数字代表蛋白质分 子量(Kda)之位置。箭头所指为EB病毒核抗原-1蛋白 质之位置。下方"+"系表示鼻咽癌患者血清,"-"则表 示正常人血清。 第七图、EB病毒核抗原-1蛋白质胺基酸序列之电脑 分析。其中之数字系表示胺基酸之排列顺序,方格 所示系亲水性区域。NH2为蛋白质之胺基端,而COOH 则为羧基端。 第八图、(A)质体pDB172之构筑简图。其中质体系以 直线形式表示,粗线表示EB病毒核抗原-1基因片段, 及 分别为噬菌体T7基因10之起动子及转录终结 子,ApR为Ap抗药性基因,A、B、E、N、P及S分别表示限 制ApaI、BamHI、EcoRI、NdeI、PvuII及SamI之切割位置; (B)聚合连锁反应所用之引子的核酸序列。其 中括弧内为原先未经改变之核酸,蛋白质之起始 译码ATG系以斜体字表示。 第九图、大肠杆菌BL21(pDB172)(DE3)菌体蛋白质之SDS- PAGE分析结果。其中之数字代表蛋白质分子量(Kda) 之位置,To及Ta分别表示经IPTG诱导前后之菌体蛋白 质。箭头所指为EB病毒核抗原-1蛋白质片段之位置 。 第十图、大肠杆菌BL21(pDB172)(DE3)菌体蛋白质和鼻 咽癌患者血清所做之西方墨渍(IgA)分析之结果。 其中之数字代表蛋白质分子量(Kda)之位置,To及Ta分 别表示经IPTG诱导前后之菌体蛋白质。箭头所指为 EB病毒核抗原-1蛋白质片段之位置。 第十一图、大肠杆菌BL21(pDB172)(DE3)菌体蛋白质,利 用鼻咽癌患者与正常人血清所做西方墨渍(IgA)之 分析结果。其中右边之数字代表蛋白质分子量(Kda )之位置。箭头所指为EB病毒核抗原-1蛋白质片段 之位置。下方"+"系表示鼻咽癌患者血清,"-"则表示 正常人血清。 第十二图、EB病毒核抗原-1蛋白质片段纯化过程之 SDS-PAGE分析结果。其中左方之数字表示蛋白质之 分子量(Kda)之位置;箭头所指系EB病毒核抗原-1蛋白 质片段之位置。第一道为IPTG诱导前之BL21(pDB172)(DE 3)菌体蛋白质,第二道为经IPTG诱导后之菌体蛋白质 ,第三道为可溶性蛋白质部份,第四道为包涵体( Inclusionbody)部份,第五道为1.2M硫酸铵沉淀物,第六 道为1.2-1.8M硫酸铵沉淀物,第七道为S-琼脂糖阳离 子交换管柱层析之流出物,第八道为S-琼脂糖阳离 子交换管柱层析之1.0M NaCl析出物,第九道则为Prep cell纯化结果。 第十三图、利用EB病毒核抗原-1蛋白质片段,以鼻 咽癌患者及正常人血清(IgA)所做酵素免疫分析之 结果。纵轴为O.D.405读値,横轴为Cut-off値,系0.17。 |
