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1、一种高表达人血清白蛋白的巴斯德毕赤酵母重组细胞的构建表达和纯化方法，其特征在于该方法包括下列步骤：一、人血清白蛋白cDNA的获得：(1)人胚肝细胞总RNA的抽提按照Trizol RNA抽提试剂盒推荐方法，从中国人胚肝细胞中抽提总RNA；(2)pre-HSA cDNA合成和PCR体外扩增根据已知天然HSA基因5’和3’端序列，设计引物：引物1:5’CGGAATTCTTATAAGCCTAAGGCAGC 3’引物2:5’CGGGATCCACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCC 3’以抽取的人肝白细胞总RNA为模板，反转录合成人血清白蛋白pre-HSA cDNA，(3)所构建的基因5’端BamH1位点与ATG之间插入了一段Kozak序列5’CCACC3’,3’端紧接基因的终止密码含一EcoR1a位点。二、HSA在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达(1)重组表达质粒pPKQ-HSA的构建：将PUC19-HSA克隆载体中pre-HSA基因片段用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切下，1％琼脂糖电泳分离，并用酚/氯仿回收。将约2Kb的pre-HSA基因回收片段与用相同酶切的pPIC3.5K表达载体连接，转化E.coli TG1感受态细胞，涂布氨苄青霉素板筛选阳性克隆。采用碱裂解法制备质粒DNA。所得质粒DNA用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定出重组质粒pPKQ-HSA。(2)表达质粒pPIC9-HSA和pPIC9k-HSA的构建设计引物：引物3：5’CGCTCGAAAAGGGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAA 3’用引物3和引物1从PUC19-HSA上PCR扩增HSA cDNA片段，酚/氯仿抽提PCR产物后，用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切回收。再与用相同酶切的pPIC9质粒连接，转化E.coli TG1感受态细胞。涂布氨苄青霉素板筛选阳性克隆。采用碱裂解法制备质粒DNA。所得质粒DNA用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切初步鉴定重组质粒pPIC9-HSA，取4个经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切初步鉴定的重组克隆，制备高纯度质粒DNA，采用5’AOX1 primer和3’AOX1 primer(Invitrogen)，测定重组质粒HSA cDNA两端序列。结果有三个含完全正确的阅读框。经测序验证的pPIC9-HSA质粒用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切并回收含HSA基因片段，与相同酶切的pPIC9-HSA质粒用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切并回收含HSA基因片段，与用相同酶切的pPIC9k质粒连接，转碱裂解法制备质粒DNA，所得质粒DNA用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定得重组质粒pPIC9k-HSA。(3)重组质粒pPKQ-HSA转化毕赤酵母细胞GS115(his4Mut+)将构建的重组表达质粒pPKQ-HSA和pPIC9k-HSA用SalⅠ或BglⅡ酶切线性化。同时将空载pPIC3.5k和pPIC9k质粒相同酶切线性化，酚/氯仿抽提回收并溶解于无菌水中。按照Invitrogen,PichiaExpression Kit Instruction Manual(Version E)方法电转化GS115细胞，涂布含不同浓度G418的YPD平板，获得不同G418抗性的阳性克隆，经MD平板验证his+表型获得GS115/HSA重组克隆S1B119。(4)重组克隆pichia pastoris GS115/HSA S1B119株细胞的表达将筛选出的GS115/HSA重组细胞接种3ml YPD试管，30℃300rpm培养过夜，再以0.2％～0.5％接种量接种50ml BMGY,30℃、300rpm培养至OD600 4～7。离心收集菌体悬于15ml含甲醇的BMMY培养液中，置20-30℃摇床诱导培养，每24hr加甲醇到0.5ml/L。定时取样，经4℃离心，上清加入PMSF至1mM,-20℃冻存；三、表达HSA的分离纯化(1)中空纤维柱将2L低密度诱导发酵液除细胞后用截留分子量10KDa-50KDa的中空纤维柱除去低于50KDa的杂质并使浓缩到0.2L浓缩液。HSA收率为95％；(2)脱色浓缩发酵液经50℃保温后，加入3％活性炭或732等脱色树脂处理10分钟后离心除去，得脱色浓缩液；(3)pharose疏水柱分离浓缩发酵液或脱色浓缩液中加入固体(NH4)2SO4至20％并流过(NH4)2SO4平衡的Phenyl-Sepharose柱，上样后用平衡液洗涤至流出液OD280＜0.01后改用水洗脱，收集用水洗脱的HSA蛋白，收率为95％；(4)亲和层析除杂蛋白①无HSA发酵液抗血清-Sepharose制备：由1所得浓缩发酵流经抗HSA抗体-Sepharose除去HSA。流出液为无HSA发酵液，按发明人论文[徐俊等，生物工程学报1993,9(1)69-73]方法将无HSA发酵液制得的抗血清，通过醛基结合于Sepharose；②疏水层析纯化得到的水洗脱峰通过“无HSA发酵液的抗血清”亲和柱，收集未吸附的蛋白峰为HSA，回收率≥98％；(5)超滤脱盐将亲和层析漏出蛋白峰经截留分子量10KDa中空纤维或超滤膜组件中脱盐。可得纯度≥99％的HSA，回收率≥98％；(6)真空冷冻干燥将脱盐后的HSA溶液真空冷冻干燥得到HSA样品。 |
