| 主权项 |
1.一种筛选转糖基β-半乳糖苷酶产生菌的方法，由下述步骤组成：(1)取菌样加入以乳糖为唯一碳源的培养液中富集培养，用无菌水将所述培养液稀释成10-1、10-3、10-5、10-7梯度，各取200μL均匀涂布于乳糖筛选平板上，细菌筛选平板选择35～40℃培养20～28小时，真菌筛选平板选择26～30℃培养48～72小时；上述细菌筛选用富集选择培养基或斜面培养基，其配方是：乳糖10±2g/L，蛋白胨5±2g/L，酵母粉10±2g/L，氯化钠3±2g/L，pH 7.0～7.5，固体培养基加琼脂20±2g/L；上述真菌筛选用富集选择培养基或斜面培养基，其配方是：土豆汁其中土豆200±2g/L，乳糖10±2g/L，琼脂20±2g/L，自然pH；(2)培养后，分别挑取形态不同的菌落，通过平板划线进行分离纯化，重复三次；(3)对分离菌株进行镜检，确定纯度：细菌以金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大肠杆菌(Escherichia coli)作对照，进行革兰氏染色，镜检可区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌；真菌制成水浸片，镜检可观察菌丝特征及孢子产生方式，初步鉴定到属；(4)将上述镜检得到的纯化菌株分别接种于产酶发酵培养液中，细菌于35～40℃摇床培养16～20小时；真菌于26～30℃摇床培养40～50小时，摇床转速为180转/分；所述产酶发酵培养基配方是：乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，CaCl2 0.11g/L，MnSO4 0.001g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，KH2PO4 0.05g/L，FeSO4·7H2O 0.03g/L，细菌pH为7.0～7.5，真菌pH为6.0～6.5；(5)待上述培养达到所需菌量后，以12,000转/分离心2～5分钟，收集产酶发酵培养液中的细菌或酵母；对于霉菌用滤纸抽滤获得菌细胞；(6)将上述菌细胞与β-半乳糖苷酶水解底物——邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG)以w/v＝mg/μL计，按菌细胞∶ONPG溶液＝1∶9的比例混合，40℃反应10～15分钟；(7)加Na2CO3溶液终止反应，以12,000转/分离心2～5分钟，收集上清液；(8)如果上清液呈黄色，说明原无色的ONPG被β-半乳糖苷酶水解成了黄色的邻硝基苯酚，即证明该菌细胞含有β-半乳糖苷酶，即为产β-半乳糖苷酶菌株；(9)将上述产β-半乳糖苷酶菌株的菌细胞，以w/v＝mg/μL计，按菌细胞∶缓冲液＝1∶1的比例，将菌细胞悬于缓冲液中，于-20℃以下温度完全冷冻后，置室温解冻，再重复冻融2～3次，如此菌细胞悬液即为β-半乳糖苷酶粗酶液；(10)将上述粗酶液以体积比计，按粗酶液∶乳糖溶液＝1∶3的比例混合，于40～60℃进行转糖基反应4～10小时，其中：乳糖溶液浓度为30％重量体积百分比，溶剂是上述缓冲液，待反应完毕后，12,000转/分离心2～5分钟，上清液即含有转糖基反应产物低聚半乳糖；(11)将上述反应产物进行薄层层析(Thin-Layer Chromatography，TLC)分析，判定酶转糖基活性，其中，展层剂为正丁醇∶乙醇∶水＝5∶3∶2，显色剂为20％硫酸溶液+0.5％的3，5-二羟基甲苯，于120℃烘烤10分钟，糖斑点的显色根据其种类从棕黄色至深紫色；如果乳糖斑点附近生成了新的寡糖斑点，则产生的β-半乳糖苷酶有转糖基活性；反之则不存在转糖基活性；(12)以寡糖斑点越大、越多，即说明酶的转糖基活性越强为依据，筛选出产转糖基β-半乳糖苷酶活性较高的菌株。 |
