METODO PARA REPRODUCIR IN VITRO LA ACTIVIDAD PROTEOLITICA DE LA PROTEASA NS3 DEL VIRUS DE LA HEPATITIS C (VHC).

摘要

ESTE ES UN METODO PARA REPRODUCIR IN VITRO LA ACTIVIDAD DE PROTEASA DE SERINA ASOCIADA CON LA PROTEINA NS3 DEL VHC. EL METODO INCLUYE EL USO TANTO DE LAS SECUENCIAS CONTENIDAS EN LA NS3 COMO LAS CONTENIDAS EN LA NS4A. ESTE METODO APROVECHA LA CAPACIDAD DE LA PROTEINA NS4A DEL VHC O DE LAS SECUENCIAS QUE CONTIENE PARA ACTUAR COMO UN COFACTOR DE LA ACTIVIDAD DE LA PROTEASA DE SERINA O, DE FORMA MAS GENERAL, DE LAS ACTIVIDADES ENZIMATICAS ASOCIADAS CON NS3. LA ACTIVIDAD OPTIMA DE PROTEASA DE SERINA SE OBTIENE CUANDO NS4A ESTA PRESENTE EN UN RADIO MOLAR DE AL MENOS 1:1, CON NS3. NS3 Y NS4A TAMBIEN PUEDEN INCORPORARSE EN LA MEZCLA DE REACCION EN FORMA DEL PRECURSOR NS3-NS4A, YA QUE ESTE PRECURSOR GENERARA, A TRAVES DE UN MECANISMO AUTOPROTEOLITICO, CANTIDADES EQUIMOLARES DE NS3 Y NS4A. TAMBIEN ES POSIBLE MUTAR EL SITIO DE RUPTURA ENTRE NS3 Y NS4A EN UN PRECURSOR PARA QUE NS4A SE MANTENGA UNIDA COVALENTEMENTE A NS3. LAS SECUENCIAS QUE NO TIENEN INFLUENCIA SOBRE LA ACTIVIDAD PROTEOLITICA DE NS3 PUEDEN ELIMINARSE A CONTINUACION DE DICHO PRECURSOR NO PROTEOLIZABLE. ESTA INVENCION TAMBIEN SE RELACIONA CON UNA COMPOSICION DE MATERIA QUE INCLUYE LAS SECUENCIAS CONTENIDAS EN NS3 Y NS4A Y CON EL USO DE ESTAS COMPOSICIONES PARA ESTABLECER UNA PRUEBA ENZIMATICA CAPAZ DE SELECCIONAR, CON FINES TERAPEUTICOS, COMPUESTOS QUE INHIBAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA ASOCIADA CON NS3. LA FIGURA MUESTRA LOS PLASMIDOS VECTORES UTILIZADOS EN EL METODO PARA ACTIVAR A LA PROTEASA DE NS3 DEL VHC EN CELULAS CULTIVADAS E IN VITRO.