Optimizing cells for endogenous gene activation

摘要

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Optimierung der Genexpression in Zellen. Ein erster Aspekt betrifft ein Verfahren zum Verändern der Expression eines in einer eukaryontischen Zelle endogen vorliegenden Zielgens durch Einführen einer heterologen Expressionskontrollsequenz in das Genom der Zelle mittels homologer Rekombination, sowie das durch eine ortsspezifische Rekombinase vermittelte Herausschneiden der inserierten Fremd-DNA und ihr Ersetzen durch weitere heterologe Expressionskontrollsequenzen oder/und Amplifikationsgene. Weiterhin betrifft die Erfindung das Einführen einer oder mehrerer Nukleinsäuresequenzen, an die ein Aktivatorprotein oder ein Aktivatorproteinkomplex, z.B. ein Hypoxia-Inducible-Factor (HIF) bindet, in das Genom einer eukaryontischen Zelle durch homologe Rekombination, um die Expression eines Zielgens zu verändern. Desweiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Testen des Einflusses 5'-seitig oder 3'-seitig nicht kodierender Nukleinsäurefragmente auf die Expression eines Zielgens durch Bestimmen der Expression eines Reportergens. Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bereitstellung einer eine RekombinaseZielsequenz enthaltende DHFR-negative eukaryontische Zelle sowie die Expression einer in der Rekombinase-Zielsequenz inserierten Nukleinsäuresequenz. <IMAGE>