人细胞色素P450系列转基因细胞株

摘要

采用DNA重组技术，通过RT-PCR从人肝组织中扩增CYP1A1、1A2、2A6、2B6、2E1和3A4 cDNA，与真核表达载体pREP9重组，导入哺乳类细胞中稳定表达，建立CYP系列转基因细胞系，应用于遗传毒理学研究，使有关致癌物的代谢活化和毒理终点测定在同一细胞内进行，进一步提高了实验的灵敏度，而且为不同CYP同功酶的代谢功能研究提供非常有用的工具。

主权项

1.一种人细胞色素P450(简称CYP)系列转基因细胞株，包括人CYP cDNA的克隆和鉴定、真核细胞表达重组体的构建和鉴定、真核细胞表达重组体导入培养细胞中表达和建株等，其特征在于：(1)人CYP cDNA的克隆和鉴定：以手术切除的人肝细胞标本及人羊膜FL细胞为起始材料，抽提总RNA，经设计的特定引物RT-PCR获得cDNA后，SouthernBlot杂交，初步对该cDNA片段进行分析和鉴定，将该cDNA片段克隆至质粒pGEM-3Z中进行序列分析和酶切图谱分析，以证实获得的基因无误。(2)真核细胞表达重组体的构建和鉴定：将克隆入重组质粒中的CYP cDNA片段用限制性内切酶切下，在电泳胶上分离回收，亚克隆入真核细胞表达载体pREP-9中，必要时酶切鉴定重组表达体上克隆片段的取向。(3)真核细胞表达重组体导入培养细胞中表达和建株：利用电穿孔转移技术将重组真核细胞表达载体导入合适的培养细胞中，用G418筛选出抗性细胞后，采用Northern Blot和CYP同功酶的活性测定技术鉴定，以获得长期稳定表达的细胞株。