| 主权项 |
1. 一种在无细胞蛋白质合成系统内合成萤光标记蛋白质之方法,由以下步骤组成:(a) 以内含一相关蛋白质用编码序列之质体(质粒)DNA培育一得自无细胞萃取物之核糖体分量试样,所述核糖体分量试样系在一偶联转录/转译培养基内并同一具有萤光标记之胺基醯基tRNA加以培育;(b) 使部份纯化之新合成萤光标记蛋白质与所述试样内之其他萤光成份分离;(c) 测量所合成萤光标记蛋白质之量;(d) 测定新合成萤光标记蛋白质之萤光;以及(e) 测定该新合成萤光标记蛋白质之生物活性,其中所述萤光标记系由香豆素及3-(4-顺丁烯二醯亚胺基苯基)-4-甲基-7-(二乙基胺基)香豆素(CPM)所组成之集团中选出。2. 如申请专利范围第1项之方法,其中所述萤光标记系在所述蛋白质之N-端上。3. 如申请专利范围第1项之方法,其中所述胺基醯基tRNA系一起始因子—胺基醯基tRNA。4. 如申请专利范围第1项之方法,其中所述萤光标记系共价键接于一起始因子—胺基醯基tRNA之胺基酸上。5. 如申请专利范围第1项之方法,其中所述转录/转译培养基将RNA聚合、三磷酸核 、一能量产生系统、利福平(rifampicin)及胺基酸含于一缓冲盐溶液内。6. 如申请专利范围第1项之方法,其中所述质体DNA为非线性化。7. 如申请专利范围第1项之方法,其中所述步骤(a)之培育约在37℃进行30分钟。8. 如申请专利范围第1项之方法,其中所述萤光标记蛋白质系由一自离心法、离子交换层析术及凝胶过滤法所组成集团中选出之方法予以部份纯化。图示简单说明:第1图显示在存在[@su1@su4C]白胺酸时予以转译或用CPM-SAc-[@su3@su5S]Met-tRNA@ssf起始之游离及核糖体结合硫氰酸(rhodanese)之分析。硫氰酸系藉偶联转录/转译作用用[@su1@su4C]白胺酸(160 Ci/mol)用CPM-SAc-[@su3@su5S]Met-tRNA@ssf (4,000 Ci/mol)作为放射性前体予以合成。培育后,反应混合物予离心。藉SDS-PAGE及放射自显影术分析上澄液及再悬浮之核糖体。放射自显影照片予以显示(首二部份分别标记成@su1@su4C-白胺酸及CPM[@su3@su5S]Met)。径迹1及2系用内[@su1@su4C]白胺酸培育所得者;径迹3及4系用N-端CPM-SAc-[@su3@su5S]甲硫胺酸培育所得。径迹1及3为20l之上澄液;径迹2及4为20l之再悬浮核糖体。第1图之第三部份(标记成抗RHO ab)显示用抗硫氰酸抗体探测之Western斑。共价键接于第二抗体之辣根过氧化物之位置系用Amersham之ECL系统显像。箭头指示牛肝天然硫氰酸之电泳淌度。第2图显示香豆素萤光藉硝基甲烷之淬灭作用。史登(Stern)—佛尔默(Volmer)之稳定状态萤光强度绘图系就释出之或结合于核糖体之CPM-硫氰酸相较于游离CPM-SAc-Met-tRNA (直线1)及结合于核糖体之此tRNA (直线6)作成。直线2为上澄液内以活性形式存在之CPM-硫氰酸;直线3为用DnaK释出之CPM-硫氰酸;直线4为用嘌呤霉素释出之CPM-硫氰酸;直线5为结合于核糖体之CPM-硫氰酸。第3图显示CPM-标记硫氰酸在成抗香豆素抗体培育前或后之萤光发射光谱。分析结合于核糖体(A)或释入上澄液(B)之CPM-硫氰酸(实线)。然后,添加抗香豆素IgG并再取得光谱(虚线)。此项插入提供所分析各个试样之定量萤光资料。第4图显示DnaJ影响抗香豆素IgG与核糖体结合CPM-硫氰酸间之交作。首先,在用稀疏霉素培育后取得CPM-硫氰酸在核糖体上之光谱(实线)。建立三份平行试样(在核糖体上用稀疏霉素培育之CPM-硫氰酸),对其添加DnaJ或DnaK单项或二者一起。取得光谱(未示出)并分析。资料经发现相同于或极类似于表VI中所列示者。然后让各试样接受抗香豆素IgG。于室温培育10分钟后取得光谱并显示于兹。(x-x) DnaJ+IgG;(...) DnaK+IgG;(--) DnaJ及 |
