| 主权项 |
1. 一种筛选具类视黄素X受体激动剂或拮抗剂活性 之化合 物之方法,该方法包括: (a) 提供一种载有命名为BJ YEpRXR(ATCC编号74197)之 表现载体之酵母菌株,其可表现融合至含有磷酸丙 糖脱氢 为组成性酵母启动子之酵母泛素(ubiquitin)融合 系统 之类视黄酸受体,且可活化含有脱辅基脂蛋白AI基 因位置 A或其突变突变体之报导者质体; (b) 使该化合物与含步骤(a)之酵母菌株之培养基及 无色 之发色性受质5-溴-4-氯-3-基--D- 喃半乳糖 恒 温培养;及 (c) 检视培养基之颜色发展。2. 一种制备可表现类 视黄素X受体之酵母寄主细胞之方法 ,其包括以命名为BJ YEpRXR(ATCC编号74197)之表现载 体及命名为BJ YEpRXR/YRpA(ATCC编号74196)之报导者 质体或命名为BJ YRpA(ATCC编号74195)之报导者质体转 形 或转感染酵母寄主细胞。3. 一种制备载有酵母RXR 表现载体之大肠杆菌寄主细胞 之方法,其包括以命名为YEpRXR(ATCC编号69145)之表 现载体转形或转感染大肠杆菌DH5菌株。4. 一种 制备载有酵母报导者质体之大肠杆菌寄主细胞之 方法,其包括以命名为YRpA(ATCC编号69144)之报导者质 体转形或转感染大肠杆菌DH5菌株。5. 一种制备 载有酵母报导者质体之大肠杆菌寄主细胞之 方法,其包括以命名为[M6]-41AI. CAT(ATCC编号69169) 之报导者质体转形或转感染大肠杆菌DH5菌株。6 . 一种制备载有酵母报导者质体之大肠杆菌寄主 细胞之 方法,其包括以命名为[M4]-41AI. CAT(ATCC编号69170) 之报导者质体转形或转感染大肠杆菌DH5菌株。7 . 一种制备载有酵母报导者质体之大肠杆菌寄主 细胞之 方法,其包括以命名为[M3]-41AI. CAT(ATCC编号69168) 之报导者质体转形或转感染大肠杆菌DH5菌株。8 . 一种制备载有酵母报导者质体之大肠杆菌寄主 细胞之 方法,其包括以命名为[A5']-41AI. CAT(ATCC编号69171 )之报导者质体转形或转感染大肠杆菌DH5菌株。 9. 一种制备选择性地感应类视黄素X受体之蛋白质 之基因 序列之方法,其包括合成具ACTGAACCCTTGACCCCTG或 ACTGACCCCTTGACCCCTG核 酸序列之寡核 酸。10. 一种脱辅 基脂蛋白AI基因位置A5'突变体,其核 酸 序列系为呈正向之ACTGACCCCTTGACCCCTG。11. 一种制备 感应非类视黄素X受体之蛋白质之基因序列 之方法,其包括合成具ACTGAACTTTTGACCCCTG或 ACTGACCTTTTGACCCCTG核 酸序列之寡核 酸。12. 一种脱辅 基脂蛋白AI基因位置A5'突变体,其核 酸 序列系为呈正向之ACTGACCTTTTGACCCCTG。13. 一种脱辅 基脂蛋白AI基因位置A5'突变体,其核 酸 序列系为呈逆向之ACTGAACTTTTGACCCCTG。14. 一种制备 表现选择性地感应类视黄素X受体之蛋白质 之表现载体之方法,其包括以根据申请专利范围第 10.12 、13项之脱辅基脂蛋白AI基因位置A5'突变体基因序 列修 饰表现载体之基因体。图示简单说明: 图1A出示RXR之酵母表现质体(YEpRXR)。人类RXR 编 码序列嵌入酵母表现载体内,产生受组成性启动子 ,磷酸 丙糖脱氢(TDH@ss3)控制之泛素(UBI)-融合蛋白质。 TRP1为色胺酸可选择性标识物,且2 micron为复制酵母 DNA。 图1B出示RXR之酵母报导者质体(YEpA)。含有2套位 置A 样模(copy)之寡核 酸作为类视黄素X感应要素(RXRE) 嵌 入异-1-细胞色素C启动子上游-250核 酸位置之酵母 报导 者质体之唯一XhoI位置中,该启动子则与大肠杆菌 之1acZ 基因融合。URA3为尿嘧啶可选择性标识物。 图2出示酵母产生之RXR与哺乳动物细胞产生之ARP -1及 RAR杂二聚化。使来自酵母细胞产生RXR之萃物( yRXR 萃物,第1-6条线)及来自未转感染酵母对照组细 胞( yCONT,第7-12条线)之萃物(40微克)与来自未转感染CMT 细胞(第1及第7条线)或来自经过表现ARP-1(第2及第8 条线 ),ARPA1(第3及第9条线)ARPA6(第4及第10条线), ARPA7(第5及第11条线)或RAR(第6及第12条线)之载 体 转感染之CMT细胞之萃物混合,利用EMSA,使用标识@su3 @ su2P之寡核 酸A作为探针分析混合物-所得到自动放 射照 片示于图中。 图3证明由酵母所产生之RXR与CMT细胞所产生ARP-1 或 RAR之间形成之杂二聚体呈高亲和力及高专一性 与位置A 结合。萃物(40微克,来自产生RXR之酵母细胞(yRXR ,第1-16条线)与经过表现ARPA1(第1-8条线)或RAR( 第9-16条线)之载体转感染之CMT细胞之萃物混合,并 利用 EMSA,使用标识@su3@su2P之寡核 酸A为探针,在所指定 体积莫耳浓度过量倍数之未标识寡核 酸A(A),寡核 酸 Amut(Amut)或寡核 酸B(B)之存在下分析,左边箭头指出 RXR/ARPA1杂二聚体与ARPA1同二聚体,右边箭头 指 出RXR/RAR同二聚体。 图4说明酵母中所产生RXR在9-顺式-RA之存在下呈 同二 聚体形式结全在位置A上。分析来自产生RXR之酵 母细胞 (yRXR,第2,3,6及7条线)及来自酵母对照组细胞( yCOTN,第4,5,8及9条线)之萃物(60微克)时,系与来自 未转感染之CMT细胞(第1-5条线)或来自经过表现ARP A1 之载体转感染之CMT细胞(第6-10条线)之萃物(2微克) 混合 后,采用EMSA,以标识@su3@su2P之寡核 酸作为探针, 于5x10@su-@su5M9-顺式-RA之存在(第3,5,7与9条线)或 不存在(第1,2,4,6,8及10条线)下进行分析。 图5说明酵母中RXR随配体变化之转录活化作用。 使带用 受体及受体质体之酵母菌种(YEpRXR/YRpA)生长在含 有 1x10@su-@su6 M全反式-视黄酸(RA),9-顺式-视黄酸(9- cis),睾甾酮(T),17--雌二醇(E@ss2),黄体酮(P@ss4 ),蜕化激素(Ecdy),甲状腺激素(T@ss3)或无激素(Con) 之培养基中。测定酵母萃物中-半乳糖 之诱 发作用( 米勒单位(Miller Units)/毫升)。数値代表三次分开实 验结果,并出示平均値之标准偏差。 图6系说明酵母中类视黄素感应性转录单位随剂量 变化之 性质。酵母菌种(YEpRXR/YRpA)系生长在含有0.01,0.1 或1.0x10@su-@su6 M全反式-RA或9-顺式-RA之培养基中 。对照组(Con)不含激素。测定酵母萃物中-半乳 糖 之诱发作用(米勒单位/毫升)。数値代表三次分开 实验结 果,并出示平均値之标准偏差。 图7出示平板分析之筛选法,供检测RXR激动剂。 将含有 RXR表现质体及报导者构筑体之酵母细胞接种至 含有发 色性受质,X-GAL@ps7,7.5@up3(@dn3@ps9,9.5(系5-溴- 4-氯-3-基--D- 喃半乳糖 之注册商标,可自马 里兰州,毕特斯达市奇布克BRL公司(Gibco BRL, Bethesda, MD)取得商品)之酵母培养基中。将含有不 同激 素之圆片(全反式视黄酸(ALL TRANS RA),9-顺式-视黄酸 (9-CIS RA),睾甾酮(T),17--雌二醇(E@ss2),黄体 酮(P@ss4),甲状腺激素(T@ss3),可体松(cortisone)( Cort)及20-羟基蜕化激素(200HE)),置于洋菜板上面。 蓝 色卤素形成反映诱发报导者酵素产生,此现象仅出 现在9- 顺式-视黄酸及全反式-视黄酸。 图8说明在位置A5'上,赋予对RXR及HNF4感应性之不 同 结构决定因子。类似已知[A]-41AI.CAT但含有不同之 位置 A5'新颖突变型之报导者集合(M2至M8;空白箭头:TGAAC ,黑体箭体:TGACC)利用暂时转感染分析法进入CV-1细 胞 中,测试其对RA存在或不存在时之RXR之感应性及 对 HNF4之感应性。各报导者构筑体系在相应配体(RA浓 度10@ su-@su6 M,所有其他配体浓度10@su-@su7 M)存在或不 存在下,接受2微克表现所指定受体之载体共同转 感染, 进入CV-1细胞中。此等细胞萃物中CAT活性依习知方 法标 准化成细胞之DNA吸收量,并相对于构筑体-41AI.CAT于 不 含有共同转感染受体表现载体或任何配位体下之 标准化 CAT活性表示(相对CAT活性)。数据代表至少二次独 立实验 之平均値。 图9说明位置5'上二段直接重覆之TGACC之间之间隙 物区中 序列CCT决定其对RXR与RA之选择感应性。类似[A5'] - 41AI.CAT,但含有位置A5'突变型之二套样模之报导者 构 筑体(其中位置A5'上二段重覆之间之间隙物中序列 CCT已 改变成TTT)(M3)系在RA及认定量ARP-1表现载体之存在 下 ,利用暂时转感染分析法进入CV-1细胞,分析其对不 同量 (如认定量)RXR或RAR表现载体之感应性,如图8所 述 |
