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<p>L'invention concerne un procédé de conjugaison de la luciférase à une entité chimique, notamment à un agent de liaison spécifique tel qu'un anticorps, un antigène ou un acide nucléique et, tout particulièrement, un anticorps, consistant (a) à mélanger la luciférase avec un ou plusieurs D-luciférine, ions magnésium et adénosine triphosphate, et (b) à provoquer une réaction de couplage covalent entre la luciférase et le réactif de liaison en faisant appel à un réactif de couplage covalent où la quantité de D-luciférine, d'ions magnésium et/ou d'adénosine triphosphate soit suffisante pour protéger l'activité de la luciférase de l'inhibition par le réactif de couplage covalent. Il es préférable d'exécuter les opérations de l'étape (a) en mélangeant la luciférase avec ses substrats en solution et que tant le magnésium que l'adénosine triphosphate soient présents sous la forme de magnésium-adénosine-triphosphate (Mg2+ATP), éventuellement avec de la D-luciférine. Le second aspect de l'invention se rapporte à une entité chimique marquée comprenant une entité chimique conjuguée à de la luciférase active comme présenté ci-dessus. Il est préférable que l'entité chimique soit un agent de liaison spécifique se prêtant à un titrage par liaison spécifique et qu'il s'agisse de préférence d'un anticorps, d'un antigène ou d'acide nucléique. Lorsque l'agent de liaison est un acide nucléique, il est préférable qu'il soit un oligonucléotide, mais il peut s'agir d'un polynucléotide ou d'un nucléoside, et il peut être utilisé comme sonde d'hybridation ou amorce d'allongement de la chaîne, par exemple, une amorce de PCR. Il est des plus profitable que cette entité soit un anticorops dans la mesure où les précédentes tentatives pour coupler des anticorps à la luciférase se sont soldées par une inactivité. L'invention a également trait à des matériels de test.</p> |
