用基因工程培育抗黄瓜花叶病毒病蕃茄的方法

摘要

利用基因工程技术将黄瓜花叶病毒(CMV)的外壳蛋白的基因转入优质蕃茄细胞后获得转基因植株并在分子水平上证实外源基因已整合到染色体上并得到表达经人工接种鉴定结果表明对CMV具有抗性，这种新的蕃茄株系既保持了原有的优良园艺性状又对CMV有稳定的抗性，适合我国种植和与抗TMV的品种杂交获得双抗杂交品种，这样植株的获得为我国蕃茄和其它蔬菜作物抗病毒育种开辟了一条新途径。

主权项

1、一种获得抗黄瓜花叶病毒CMV转基因蕃茄的方法，其特征是 所述方法是包括：分离筛选、鉴定、克隆CMV-cp基因；将该基因转 入蕃茄细胞后经组织培养，诱导愈伤组织，诱导再生植株， (1)分离、筛选、鉴定克隆CMV-cp外壳旦白基因： 从山东大田的发病烟叶中，提取CMV病毒，用聚乙二醇6000沉淀 植物组织抽提液，经差速离心，超速离心和蔗糖密度梯度离心(10— 40％)后得到提纯的病毒，将病毒液用蛋白酶K消化，苯酚氯仿(1∶1)抽 提，乙醇沉淀，得到病毒RNA； cDNA的合成与克隆： 人工合成一段含24个核苷酸的DNA序列作为引物：5′一 TGGTCTCCTTATGGAGAACCTGTG—3′该引物由北京大学生命 中心ABIDNA合成仪合成，可以与CMVRNA1—4的3′端互补，cDNA的 合成是以CMV的总RNA为模板； 双链cDNA用T₄DNA聚合酶进行末端补平，将质粒Bluescript用 EcoRV切开作为载体，用T₄DNA连接酶连接后，转化到大肠杆菌DHS细 胞中，转化菌经筛选后，挑出其中白色菌落进行分析； 筛选和鉴定重组质粒，CMV外壳蛋白基因中有一个ECoRI酶切位 点，其它RNA序列中没有，故用ECoRI酶切的方法筛选重组的质粒； DNA序列分析：将全长的cDNA克隆用多种限制性内切酶切开，并 亚克隆在Bluescript载体上，以双脱氧核苷酸链终止法，直接用双链 DNA测定其cDNA序列；即先将超螺旋的质粒DNA在0.2mol/LNaOH中变 性5min，再以0.4倍体积的5mol/LNH₄Ac中和，乙醇沉淀，变性的质 粒和序列引物一起退火，然后按Chen和Seeburg的方法测定DNA序列； cDNA的合成：在合成cDNA的第一链和第二链时，都加入了α-³²P- dATP，经碱性胶电泳后，得到放射自显影的X光片，最长的cDNA片段 可达3kb；而CMVRNA基因组在1.0—3.4kb范围内，所以从合成的cDNA 中获得外壳蛋白基因的完整序列； 重组质粒的筛选和鉴定：cDNA经连接转化后得到900多个白色菌 落，经小量提取质粒，EcoRI酶切分析后得到21个阳性克隆，插入片 段在0.5—2.0Kb之间，对其中的一个质粒PHC210的插入片段进行了部 分DNA序列分析，发现与发表的CMV—D株系的外壳蛋白基序列相吻合； pHC210质粒插入片段的完整序列分析及与其它株系间外壳蛋白基 因同源性的比较： 经酶切测定，pHC210质粒的插入片段约有1Kb，为了测定其完整 序列，先分析了这段DNA的物理图谱并进而做了不同酶切片段的亚克 隆；这段DNA的限制性内切酶点是：SaII(0.1Kb)，EcoRI(0.35Kb)， HindIII(0.36Kb)，XhoI(0.63Kb)，SaII(0.66Kb)；其中EcoRI (0.35Kb)和SaII(0.66Kb是CMV—D的相应序列中所没有的，其它位点 和CMV—D一致；DNA序列分析的结果证实了这一点； 通过对pHC210质粒插入片段的四种亚克隆的DNA序列分析，得到 了该质粒完整插入片段的序列，经与CMV—D的外壳蛋白基因比较，发 现该质粒中含有完整的CMV外壳蛋白基因；该片段全长1008bp，5′端 非编码区53bp，3′端具有完整的301bp的非编码区，外壳蛋白基因编 码区654bp；这段1008bp的序列与CMV—D的相应序列相比，同源率为 92.6％，其中基因编码的同源率为93.9％；与CMV—Q的相应序列相比， 同源序列占73.1％，基因编码区的同源序列占77.1％；由这段序列推知 该基因编码的蛋白含218个氨其酸残基，分子量为24060；与CMV—D 外壳蛋白所含氨基酸残基数相等，分子量也很接近(后者分子量为 24100)；序列同源率为96.3％CMV—Q外壳蛋白含有较多的氨基酸残基 (236个)，相比之下，二者的同源氨基酸序列占71.5％； 根据血清学反应和核酸序列同源性的比较可以将CMV的绝大部分 株系分为两个亚组；CMV—Q、CMV—R、CMV—S等属于一个亚组，CMV —D、CMV—C、CMV—Ma等属于另一个亚组；上述cDNA序列同源性比 较表明，流行于我国的这种CMV株系应属于CMV—D所在的亚组； (2)将CMV—cp基因转入蕃茄细胞后经组织培养，诱导愈伤组织， 诱导再生植株：根瘤脓杆菌菌种GV311SE培养在附加卡那霉素 Kanamicin50mg/l，壮观霉素Spectinomycin50mg/l，氯霉素 chloromycercin30mg/l的LB液体培养基中，26-28℃下100rpm的摇 床中过夜培养，菌液培养好后，在冰冻离心机上离心(5000rpm5分 钟)，取沉淀，用1/2MS液体培养基溶解沉淀，在可内光λ＝600时测 定0.D值(0.D值在0.15—0.25范围内较合适)；这时的菌液即可用于转 化；利用外源激素适当搭配掌握合适的浓度获得组培系统优化条件如 下： 基本培养基采用MS培养基的大量元素及微量元素成份，其中B5培 养基的维生素成份，蔗糖用量为3％，琼脂用量为8％，另加不同浓度的 各种激素和微量元素，PH调至5.8，在121℃下高压灭菌15分钟； 本实验所用的培养基成分如下： MS培养基(mg/L)微量元素成分： NH₄NO₃1650MnSO₄4H₂O22.3 KNO₃1900ZnSO₄7H₂O8.6 CaCl₂H₂O440H₃BO₄6.2 MgSO₄7H₂O370KI0.83 KH₂PO₄170Na₂MoO₄2H₂O0.25 Na₂EDTA37.3CoCl₂6H₂O0.025 FeSO₄7H₂O27.8CuSO₄5H₂O0.025 B₅培养基维生素成份：mg/L肌醇100，VB₆1.0； 烟酸1.0，VB₁10； 本实验再生诱导培养基的激素成份如下： 蕃茄再生诱导培养基的激素成分 激素 激素浓度mg/L 培养基号 激素种类 IAANAA2，4-DBAZTGA胱氨酸 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 0.22.0 0.22.0 0.21.0 0.52.0 1.02.5 2.0 2.0 0.515 2.0 2.02.0 其中：IAA：吲哚乙酸，ZT：玉米素，BA：6-苄基氨嘌呤， NAA：α-萘乙酸，2，4-D：2，4—二氯苯氧乙酸，GA：赤霉素 切取7—10天苗龄的蕃茄的子叶和下胚轴，用解剖刀切成0.5cm， 左右的小块或小段，在M1—M9培养基上培养3—4周，每个10cm培养皿 放置20块外植体，重复一次，其实验结果如下所示： 各种培养基诱导蕃茄外植体再生的结果(品种苏8805) 重 复 分培 化养 数基 M₁M₂M₃M₄M₅M₆M₇M₈** 重一 20块/皿 (芽)块/皿 (芽)个/块 161415141015177 2.02.12.33.31.42.03.01.2 重复二 20块/皿 (芽)块/皿 (芽)个/块 17181313814106 3.11.71.93.01.11.91.51.7 平均 (芽)块/皿 ** (芽)个/块 16.5161413.5914.513.56.5 82.5％80％70％67.5％45％72.5％67.5％32.5％ 2.61.92.13.21.32.02.11.5 *M₆，M₇的分化数指的是愈伤组织的分化数， **指的是分化百分数， 从以上结果看出：M1、M2培养基分化最好，生芽最多；M3、M4培 养基较多；M6、M8培养基产生愈伤组织；所以选用M1、M2培养基为主、 辅之M3、M4培养基作为诱导转化植物外殖体以获得转化幼苗。