猪紧迫敏感症基因型血样快速检测法

摘要

调节骨略肌钙离子ryanodine receptor基因若发生突变，猪只在受到紧迫时，产生紧迫症状，易导致猪只猝死。本发明方法系用少量新鲜血液或保存于滤纸上之乾燥血液中之DNA为模版和特别挑选之核酸为引子进行聚合链反应，将ryanodine receptor基因上之特定去氧核醣核酸(DNA)序列片段大量增殖，再用内切限制进行酵素分解，经由琼脂胶体电泳作去氧核醣核酸之片段分离，藉以判读该基因之基因型。本法以简易之操作可以彻底区分纯合子正常基因型，纯合子突变基因型及杂合之三种基因型，使混杂于种猪群中不表现紧迫敏感症状而携带一份突变基因的杂合子猪只得以被筛检，进行精肉型但不表现紧但敏感症状猪之育种。

主权项

1. 一种直接检测猪紧迫敏感症致病基因之快速检 测法, 系使用抗凝血样或滤纸乾燥血样,聚合链反应, 内切限 制酵素分解,和琼脂胶体电泳分析判读基因型, 其包括 : 聚合链反应中所使用一对引子为特别挑选, 其上游 引子序列为5@su'-CTCTT,TGACC,TTGAT,CTCC-3@su', 位于第六条染色体ryanodine receptor基因距突变点上 游 (5@su'端)第229至210之20个硷基序列,下游引子序列为 5 @su'-GGTGG,TGGAG,GGTTC,TAAGC-3@su',其位置距突 变点下游(3@su'端)第133至114个硷基序列之互补硷基 序 列,于聚合链反应后增殖一段长363个硷基之独一 序列 片段; 聚合链反应之DNA模板可直接以抗凝血液, 或滤 纸保存之乾燥少量血液获得; 聚合链反应中,镁离子以1-2mM,dNTP以0.1-0. 5mM,引子以0.1-1.0M较为合适; 聚合链反应之反应温度及时间分三阶段,以 DNA变 性期,93℃-99℃,2分钟以上,DNA大幅增殖期,93℃ 至99℃间20秒以上,接着58℃至62℃间20秒以上;接着 68 ℃至74℃间20秒以上为一循环,共反覆进行至少15个 循环 ,最后DNA修补期,68℃至74℃间,40秒以上较为合适 ; 聚合链产物若可被内切限制Hha I分解,表示 此基 因为正常基因型,若产物可被内切限制BsiHK AI分 解, 表示此基因为突变基因型。2. 如申请专利范围第1 项所述方法,其中内切限制分解 聚合链产物系使用琼脂胶电泳分析法及快速照 相之简易 组合快速判读基因型。图示简单说明: