人白细胞介素-6的制备方法及其产物

摘要

一种人白细胞介素-6的制备方法及其产物，方法包括：人白细胞分离；白细胞总mRNA分离；人工合成含有限制性内切酶切点的引物；cDNA合成，其产物核苷酸序列全长为486个核苷酸，所获得的IL-6的cDNA克隆到质粒载体上，载体pFrc的启动子是-35(trpB)与-10(LacUv)的杂合启动子；经诱导高效表达后得高活性IL-6蛋白，它是162个氨基酸残基，其表达活性是全长成熟蛋白的2.8倍。

主权项

1、一种人白细胞介素-6的制备方法，其特征在于它包括以下几个步骤： (1)血液中白细胞分离； (2)白细胞总mPNA的分离：按Pharmacia的微量mRNA纯化的试剂盒方法分离； (3)人工合成含有限制性内切酶切点的引物，在合成的上游引物中导入了BamHI位点，在合成的下游引物导入了EcoRI位点，其引物的序列为： PL5′CGGGATCCGCATGGAACGAATTGACAAACAA3′ PR5′CGGAATTCATTACATTTGCCGAAGAG3′ (4)CDAN合成：在含有人白细胞介素-6mRNA合成引物的存在下，利用逆转录酶的DNA合成系统，通过聚合酶链反应(PCR)扩增IL-6基因片段，其核苷酸序列为： ATGGAACGAATTGACAAACAAATTCGGTACATCCTCGACGGC 10 ATCTCAGCCCTGAGAAAGGAGACATGTAACAAGAGTAACATG 20 TGTGAAAGCAGCAAAGAGGCACTGGCAGAAAACAACCTGAAC 30 CTTCCAAAGATGGCTGAAAAAGATGGATGCTTCCAATCTGGA 50 TTCAATGAGGAGACTTGCCTGGTGAAAATCATCACTGGTCTT 6070 TTGGAGTTTGAGGTATACCTAGAGTACCTCCAGAACAGATTT 80 GAGAGTAGTGAGGAACAAGCCAGAGCTGTGCAGATGAGTACA 90 AAAGTCCTGATCCAGTTCCTGCAGAAAAAGGCAAAGAATCTA 100110 GATGCAATAACCACCCCTGACCCAACCACAAATGCCAGCCTG 120 CTGACGAAGCTGCAGGCACAGAACCAGTGGCTGCAGGACATG 130140 ACAACTCATCTCATTCTGCGCAGCTTTAAGGAGTTCCTGCAG 150 TCCAGCCTGAGGGCTCTTCGGCAAATGTAG 160164 (5)IL-6cDNA克隆和大肠杆菌转化： 经EcoRI+BamHI酶切的pTrc载体和IL-6cDNA连接，该表达载体pTrc的启动子是-35(trpB)与-10(lacVW₅)的杂合启动子；载有IL-6基因的质粒经培养获得阳性克隆的大肠杆菌。 (6)IL-6纯化，测定。