一种人实体肿瘤血管内皮细胞增殖抑制因子的基因克隆方法及在抗肿瘤血管再生治疗中的应用

摘要

一种人实体肿瘤血管内皮细胞增殖抑制因子的基因克隆方法及在抗肿瘤血管再生治疗中的应用,其特征在于:a.人endostatin基因是从人胶原蛋白十八基因1503至2055cDNA活性片段通过PCR从人肝脏cDNA库中筛选得到;b.人endostatin基因通过内切酶酶切所得到的两种基因片段;c.人endostatin基因及其b项所述2个基因片段通过基因克隆方法在大肠杆菌中表达,具有抑制血管内皮细胞增殖和抗肿瘤血管再生活性而作为生物制品用于治疗实体肿瘤。

主权项

1、一种人实体肿瘤血管内皮细胞增殖抑制因子(human endostatin)-即人实体肿瘤血管再生抑制因子的基因克隆方法，其特征在于：a.人endostatin基因的基因克隆方法是从人胶原蛋白十八(human typeXVIII collagen)基因1503至2055cDNA活性片段通过PCR方法从人肝脏cDNA库中筛选得到，首先制备两种引物分别为ATTCATATGCACAGCCACCGCGACTTCCAGCCG和GCCGGATCCCTACTTGGAGGCAGTCATGAAGCT，以人肝脏cDNA库为模板，以PCR条件为94℃ 1分钟，55℃ 1分钟和72℃ 1分钟共计32个循环而得到人endostatin基因，通过NdeI和BamHI两种内切酶而克隆入PMAL-c2和PET19b、PET9c基因载体，然后在大肠杆菌中表达，纯化得到有活性的重组人endostatin蛋白质；b.采用PstI内切酶从人endostatin基因N末端切去162个核苷酸或采用PstI和SmaI内切酶分别从人endostatin基因N末端和C末端切去162和264个核苷酸后所得基因片段而克隆入PMAL-c2和PET15b、PET9c基因载体，然后在大肠杆菌中表达，纯化得到有活性的重组人endostatin蛋白片段；c.将纯化得到的重组人endostatin蛋白质及b项所述2个重组蛋白片段加入含有bFGF的牛肾上腺毛细血管内皮细胞培养液中，培养3天后通过细胞计数，测量它们的毛细血管内皮细胞增殖抑制作用活性强度。