METHOD FOR DIRECT SEQUENCING OF NUCLEIC ACID CHAINS USING THE POLYMERASE CHAIN REACTION AND DEOXYNUCLEOSIDE THIOTRIPHOSPHATES.

摘要

Un procédé pour le séquençage direct de chaînes d'acides nucléiqus par dénaturation suivie de l'amplification des régions à séquencer par répétion d'un cycle comporte a) une étape de synthèse d'acides nucléiques, dans laquelle l'acide nucléique à séquencer est répliqué sous forme d'un brin matriciel, en présence des quatre triphosphates de désoxynucléosides, par une polymérase, à partir d'oligonucléotides amorces qui sont complémentaires des terminaisons 3' des brins anti-parallèles des acides nucléiques à séquencer; suivie b) d'une étape de dénaturation. Les terminaisons des acides nucléiques obtenus sont marquées pendant ou après l'amplification. Le séquençage des acides nucléiques marqués s'effectue par incorporation, à des positions spécifiques d'une base, de nucléotides modifiés, raccourcissement, jusqu'à ces positions, des acides nucléiques amplifiés et séparation par électrophorèse des fragments d'acides nucléiques résultants. Les nucléotides modifiés sont incorporés, lors de l'amplification en quatre cycles différents, grâce à l'emploi d'un thiotriphosphate alpha de désoxynucléoside conjointement avec les trois autres triphosphates de désoxynucléosides non modifiés, à la place des quatre triphosphates de désoxynucléosides.