一种用骨基质凝胶构建组织工程软骨的方法

摘要

一种用骨基质凝胶构建组织工程软骨的方法，首先用软骨细胞分离培养或基质干细胞分离培养诱导为软骨细胞即获取种子细胞，然后取新西兰兔长骨和干骺端松质骨构建骨基质凝胶BMG，将分离培养收获的种子细胞按4-10万/mm²密度接种于皮质骨或松质骨BMG上进行体外培养，培养基为含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液，每3天换液一次即可。由于本发明采用骨基质明胶具有较好的生物相容性、可降解性，较强的诱导骨、软骨生长、分化作用的优势，克服植入体内后吸收过快、机械强度不足的问题；能够获得正常或接近正常结构与功能的骨软骨组织的良好效果。

主权项

1、一种用骨基质凝胶构建组织工程软骨的方法，其特征在于：1)种子细胞获取软骨细胞的分离培养①取材：出生4周左右的新西兰死兔1只，脱毛，洗涤干净，用0.1％的新洁尔灭浸泡20-30分钟，以无菌操作截取肱骨近端，股骨近、远端和胫骨近端，置于含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液中，清除一切软组织，片状削下各关节面软骨，置入盛有含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液的容器内，而后吸出液体弃去，用10ml质量百分比浓度为0.05％的透明质酸酶室温下消化3分钟，弃去酶液，用含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液洗涤后，将软骨切成1mm3大小的小粒；②细胞分离：将软骨小粒转入消化小室内室，加入5ml质量百分比浓度为0.2％的胰蛋白酶，于37℃磁力搅拌下消化30分钟，而后吸出酶液弃去，再加入5ml质量百分比浓度为0.2％的胶原酶，于37℃磁力搅拌下消化60分钟，吸出含细胞酶液，置入对半盛有含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液的10ml离心管内，在1500rpm离心3分钟，弃去上清收集细胞，重复消化一次后合并两次收集的细胞，用含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液或含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液洗涤1-2次；③原代培养：以40万个/瓶将细胞接种于5cm×5cm×3cm的培养瓶中，培养基为含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液4ml，于37℃的CO2培养箱中培养，首次换液间隔72小时，以后则隔日换液，直至形成细胞单层；④传代培养：将原代培养已形成细胞单层的各瓶中培养液弃去，用含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液将细胞洗1-2次，加入4ml质量百分比浓度为0.25％trypsin+0.02％EDTA的消化酶液，于37℃消化10分钟，将含细胞酶液倒入50ml离心管内，再用含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液或含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液2ml洗涤1-2次，使瓶内细胞全部洗脱下来，于1500rpm离心3分钟，弃去上清即获得软骨细胞；2)骨基质凝胶BMG的制备：①相对无菌条件下取新西兰兔长骨和干骺端松质骨，除去所有软组织及骨髓后用蒸馏水洗净；②用3mol/L的叠氮钠冲洗2～3次再用蒸馏水洗；用1∶1氯仿/甲醇于室温磁力搅拌下过夜脱脂，蒸馏水洗；③用0.6mol/L的盐酸在4℃磁力搅拌脱钙，期间每4小时换液一次，直至骨块变软且具一定弹性时终止脱钙，再用蒸馏水洗至中性；④4℃磁力搅拌下：用2mol/L氯化钙处理1小时，蒸馏水洗；0.5mol/L的EDTA处理1小时，蒸馏水洗；8mol/L氯化锂处理1小时，蒸馏水洗；⑤无菌蒸馏水55℃处理1小时；⑥将处理好的BMG修剪成实验设计所需的尺寸，冻干，60钴源照射灭菌后于0℃～-20℃冰箱内保存备用；3)组织工程软骨的构建：将分离培养收获的种子细胞按4-10万/mm2密度接种于皮质骨或松质骨BMG上进行体外培养，培养基为含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液，每3天换液一次。