METHOD OF DETERMINING NUCLEOTIDE SEQUENCES IN CELLS AND OF ISOLATING NUCLEIC ACIDS FROM CELLS

摘要

Avant de pouvoir analyser les acides nucléiques présents dans des cellules, le problème de leur isolation s'est toujours présenté à cause des procédés d'extraction difficiles ayant recours au phénol ou à une protéase par exemple. La présente invention fournit un procédé d'analyse qui peut être effectué sur un lysat de cellules brutes, sans qu'il soit nécessaire d'avoir recours à une telle extraction. Le procédé consiste à effectuer la lyse des cellules dans un tampon de lyse comprenant un agent chaotropique pour dissocier les nucléoprotéines et qui inhibe la nucléase, p. ex. un sel de guanidinium présent dans le lysat en une concentration d'au moins 3 M au moment de l'hybridation, lorsque l'ADN est en train d'être déterminé en traitant le lysat pour le rendre monobrin, en mettant en contact le lysat dans des conditions d'hybridation avec un polynucléotide ayant une séquence nucléotide complémentaire par rapport à une séquence présente dans l'acide nucléique à déterminer, et en déterminant le degré d'hybridation, p. ex. par une analyse en sandwich ou compétitive. Un procédé similaire peut être utilisé pour extraire l'acide nucléique de la cellule par un procédé d'hybridation et isoler l'acide nucléique désiré de l'hybride résultant.