| 主权项 |
1﹒一完全被还原之重组蛋白质,系选自-干扰素,间白血球溶卤素-2及其突变蛋白质之氧化方法,其中半胱氨酸优先被氧化形成二硫化物桥链这相当于那些存在自然发生之蛋白质内,此方法之特征是将一含经增溶之重组蛋白质溶液于pH5.5和9之间,在空气的存在下与至少一有效量之含Cu+2阳离子之氧化促进剂反应。2﹒依申请专利范围第一项之方法,其特征在重组蛋白质是所说的蛋白质之一突变型,其本身所有的半胱氨酸残余部份中至少有一可自由形成一二硫化物键而且此被切除或被其他氨基酸取代对蛋白质之生物活性并不是主要的。3﹒依申请专利范围第2项之方法,其特征在此突变蛋白质是des一alaIL一ser125图或IFN-SER17。4﹒依申请专利范围第1,2,或3项之方法,其特征在pH是在约6和约8之间。5﹒上依申请专利范围第1,2,或3项之方法,其特征在氧化促进剂是氯化铜或(O一菲绕 )2 铜离子复合物。6﹒依申请专利范围第1,2,或3项之方法,其特征在所说的蛋白质之浓度是在约0. 05-约2毫克/毫升。7﹒依申请专利范围第1,2,或3项之方法,其特征在被氧化形成胱氨酸的蛋白质上,所说的氧化促进剂之浓度是大约等于自由氢硫基之浓度。8﹒依申请专利范围第1,2,或3项之方法,其侍徵在氧化促进剂是氯化铜,其浓度范围约为1-40Om。9﹒依申请专利范围第1,2,或3项之方法,其特征在此蛋白质是用硫酸十二碳酯钠或尿素使增溶。10﹒依申请专利范围第1项之方法,其特征在此蛋白质是-IL-2或lFN-突变蛋白质,氧化促进剂是氯化铜,其使用浓度约5-5Om,反应之pH是约7,IL-2或IFN-突变蛋白质在反应混合物内之浓度范围约0.1-1毫克/毫升,并使用硫酸十二碳酯钠作为一增溶剂,其使用浓度为单位体积中约0.1-1%重。图示简单说明:图1代表五个逆相高压液体色层分析(RP-HPLC)-反应混合物之吸光剖面。其中IFN-之一重组体突变型蛋白质本身在17位上所具有的半胱氨酸残余部份被一丝氨酸残余部份取代(在这里称之为IFN-ser17),已经利用8M氯化铜作为促进剂使其氧化。图1A代表一控制反应包括已还原的IFN-ser-17己经在一不含氯化铜之缓冲液内7分钟被取代。图1B代表含氯化铜之氧化7分钟;图lC代表氧化14分钟;图lD代表氧化28分钟;而图1E则表示氧化75分钟的结果。图1F代表以被氧化之IFN-ser-17百分比对氧化时间作图,以RP-HPLC分析为主。图2是在8M氯化铜内氧化75分钟之后之重组型IFN一Bser17图2A)与等量之相同物质在l0mM二硫苏力糖醇(di-thiothreitol)在5OC下退原115分钟(图2-B)之一比较图。图3代表IL-2之一重组体突变型蛋白质,于125位上之半胱氨酸残余部份被一丝氨酸残余部份和具N一端丙氨端切除(在-这里称之为des-alalL-2ser125)己经图5OM氯化铜氧化促进剂氧化过之一反应混合物之四个RP-HPLC吸光剖面。图3A代表氧化2分钟;图3B代表氧化l0分钟;图3C代表氧化50分钟;图3D代表反应混合物经50分钟氧化后之生成物再用l0mN二硫苏力糖醇于60℃再退原15分钟之一色层分析。图4代表一银染色,使5OM氯化铜作为氧化促进剂经氧化40分钟之后des-alaIL一2ser125 蛋白质之非还原SDS-PAGE分析以决定分子间氢硫基形成程度(寡紧物)。图5代表des-aIa-2ser125之氧化百分比对在25℃三种不同氯化铜浓度内反应时问(分)作图(以HPLC峰高测量之,较少背景)同时进行含10mM乙二胺三醋酸(EDTA)之对照反应。。图6代表des-alaIL-2ser125之氧化百分比(测量HPLC峰高,较少背景)对使用sM氯化铜氧化反应之pH作图。此图二显示各种不同PH对反应速率的影响。在IL-2大约有50%被氧化的那一点测量之。图7代表des-alaIL-2ser125使用邻一菲绕 (o-phen-anthroline)/铜离子复合物之氧化反应(图7A)与使用氯化铜之氧化反应(图7B)比较。图8代表deS -alalL-2ser125被氢化之百分比(测量与DTNB及应决定自由氢硫基消失情形)对时间(分)作图,于25℃它用5OM氟化铜,0.25毫克/毫升之部分纯化适之IL-2,50mM磷酸钠,0.1%SDS,在PH7.0下进行反应。图9代表使用50M氯化铜氧化过之IL-2之HPLC-纯化过之IL-2在-还原和非还原凝胶之SDS-PAGE分析。des-alanylIL-2(在天然IL-2内含三个半胱氨酸)之氧化产物的RP-HPLC吸光剖面。 |
