CRP单克隆抗体纳米乳胶微球组合物及制备工艺

摘要

本发明公开了一种CRP单克隆抗体、CRP抗体纳米乳胶微球组合物及制备工艺；所述CRP抗体纳米乳胶微球组合物为不同抗原表位的CRP单克隆抗体，与不同粒径的羧基化聚苯乙烯微球共价交联形成偶联物，然后将不同偶联物按一定比例混合制成CRP单克隆抗体纳米乳胶微球组合物。本发明所述的CRP单克隆抗体纳米乳胶微球组合物与全自动生化分析仪、特种蛋白分析仪匹配，可全量程测定人全血和血清中C反应蛋白浓度，应用于细菌与病毒性感染的鉴别诊断、药物治疗监测及心血管疾病的风险评估。

主权项

一种CRP抗体纳米乳胶微球组合物，其特征是：所述纳米乳胶微球组合物由两种偶联物组成：一种偶联物为CRP单克隆抗体和粒径80nm的羧基化聚苯乙烯微球在缓冲液中混合，在活化剂的作用下，聚苯乙烯微球上的羧基与抗体上的氨基缩合形成的偶联物；另一种偶联物为CRP多克隆抗体和粒径220nm的羧基化聚苯乙烯微球在缓冲液中混合，在活化剂的作用下，聚苯乙烯微球上的羧基与抗体上的氨基缩合形成的偶联物；所述的CRP单克隆抗体通过以下方法制备：⑴.人血清CRP的分离纯化：a.采用硫酸铵沉淀人血清中的总蛋白；b.使用DEAE柱对步骤a获得的总蛋白进行初级纯化；c.采用CNBr‑activated Sepharose 4B对步骤b获得的初级蛋白进行精细纯化，获得人血清CRP；⑵.CRP单克隆抗体的制备e.采用步骤c获得的人血清CRP作为抗原免疫BALB/c小鼠，至免疫后的小鼠血清与抗原有特异性结合，且使用Dot blot测定抗血清效价在1：10000以上，则进入步骤f；f.采用颈椎脱臼法处死步骤e获得的免疫后且血清效价达标的的小鼠，采用PBS冲洗脾脏内部，收集1×10⁸个淋巴细胞；g.将步骤f获得的淋巴细胞与NS‑1骨髓瘤细胞进行细胞融合，获得融合细胞；h.采用HAT培养液对步骤g获得的融合细胞进行选择培养，获得杂交瘤细胞；i.采用HAT选择培养基对步骤h获得的杂交瘤细胞进行培养至细胞集落为20%时，先采用间接ELISA筛选法对培养后的杂交瘤细胞进行阳性克隆筛选，筛选出的阳性克隆再利用Western blot法进行阳性克隆筛选；最终保留两种筛选方法均为阳性的杂交瘤细胞株；其中间接ELISA筛选的方法为：用步骤c获得的人血清CRP作为抗原包被酶标板，以步骤h筛选得到的杂交瘤细胞培养上清为一抗，以NS‑1细胞培养上清作为阴性对照，分别将一抗阴性对照加入抗原包被的酶标板中，于37℃孵育1.5小时；以HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，再将二抗加入酶标板中，37℃孵育1小时；最后以TMB显色，测A450OD值；其中CRP蛋白包被板的A450值高于阴性对照板的A450值2.1倍以上的融合细胞株视为阳性；j.利用有限稀释法对步骤i获得的经间接ELISA法和Western blot法筛选均为阳性的杂交瘤细胞进行克隆化，直至采用间接ELISA检测阳性率达100%，将阳性细胞扩大培养，冻存杂交瘤细胞；k.用步骤j获得的杂交瘤细胞接种于BALB/c小鼠腹腔，获得腹水；l.采用二氧化硅吸附法对步骤k获得的腹水进行预处理，获得澄清的腹水；m.采用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠球蛋白抗体对步骤l获得的澄清腹水进行亲和纯化，获得纯化后的CRP单克隆抗体；n.对步骤m获得的CRP单克隆抗体的亚型进行鉴定，选择亚型为IgG1的CRP单克隆抗体。