一种植物原生质体中液泡内、外硝态氮含量的测定方法

摘要

本发明提供了一种植物原生质体中液泡内、外硝态氮含量的测定方法，包括以下步骤：（1）植物细胞原生质体的提取；（2）植物细胞原生质体中液泡的提取；（3）原生质体中液泡内、外硝态氮含量的测定：在光镜下检测上述液泡中叶绿素的含量和细胞色素c氧化酶的活性，以确定提取液泡的纯度，并且测定提取液泡中硝态氮的含量，最后分别测定原生质体和液泡中酸性磷酸酶的活性，并将原生质体和液泡中硝态氮的含量用酸性磷酸酶的活性标准化，经计算得到原生质体中液泡内、外硝态氮的含量。本方法可以准确测定出原生质体中液泡内、外硝态氮的含量；提取完好原生质体的效率在90%以上；完好液泡的提取效率在95%以上。

主权项

一种植物原生质体中液泡内、外硝态氮含量的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)植物细胞原生质体的提取：取幼苗叶片，加入预冷的研磨缓冲液研磨，研磨液经过滤、离心，得到的沉淀即为原生质体，用悬浮缓冲液悬浮后得原生质体悬浮液，分为两等分，其中一份用于硝态氮含量的检测，另一份用于提取液泡；其中所述研磨缓冲液pH为7.6，包括23～27mmol·L^‑1 4‑羟乙基哌嗪乙磺酸‑缓血酸胺，200～300mmol·L^‑1甘露醇，4～7mmol·L^‑1乙二醇双(2‑氨基乙基醚)四乙酸,3～6mmol·L^‑1乙二胺四乙酸二钠，8～15mmol·L^‑1KCl,1～3mmol·L^‑1苯甲基磺酰氟，5‑20mg·L^‑1聚乙烯吡咯烷酮，3～7mg·L^‑1牛血清白蛋白，3～6μg·L^‑1 2,6‑二叔丁基‑4‑甲基苯酚，4～7mmol·L^‑1K₂S₂O₅，0.8～1.2mmol·L^‑1二硫苏糖醇，所述二硫苏糖醇在所述研磨缓冲液使用前加入；所述悬浮缓冲液pH为7.6，包括2.3～2.8mmol·L^‑1 4‑羟乙基哌嗪乙磺酸‑缓血酸胺，200～300mmol·L^‑1甘露醇，0.8～1.2mmol·L^‑1乙二胺四乙酸二钠，0.9～1.1mmol·L^‑1二硫苏糖醇，所述二硫苏糖醇在所述悬浮缓冲液使用前加入；(2)植物细胞原生质体中液泡的提取：取上述用于提取液泡的原生质体悬浮液，加入至蔗糖溶液中，采用蔗糖密度梯度离心法离心，用移液枪吸取离心液中从上往下数的第二层溶液，即得到植物液泡；其中所述蔗糖密度梯度离心法的步骤包括：将悬浮液置于不连续蔗糖梯度：45％、36％、22％的蔗糖溶液中，经70000×g离心2h，取22％和36％区带，再加入悬浮液，经80000×g离心40min；(3)原生质体中液泡内、外硝态氮含量的测定：在光镜下检测上述液泡中叶绿素的含量和细胞色素c氧化酶的活性，以确定提取液泡的纯度，并且测定提取液泡中硝态氮的含量，最后分别测定原生质体和液泡中酸性磷酸酶的活性，并将原生质体和液泡中硝态氮的含量用酸性磷酸酶的活性标准化，经计算得到原生质体中液泡内、外硝态氮的含量；其中所述植物为油菜或烟草。