克伦特罗单克隆抗体的制备及其应用

摘要

本发明提供了一种克伦特罗单克隆抗体及其应用。本发明公开了一种克伦特罗单克隆抗体的制备方法，通过合成克伦特罗半抗原以及克伦特罗半抗原与载体蛋白免疫得到克伦特罗抗原，将其免疫动物得到高特异性单克隆抗体。本发明还提供的一种将克伦特罗单克隆抗体应用于克伦特罗酶联免疫试剂盒检测克伦特罗的方法。本发明还提供了一种将克伦特罗单克隆抗体应用于克伦特罗胶体金试纸卡检测检测克伦特罗的方法。本发明制备得到的克伦特罗单克隆抗体特异性高，成本低，以此克伦特罗单克隆抗体制备的克伦特罗酶联免疫试剂盒和胶体金试纸卡检测克伦特罗药物具有操作方便、检测成本低、特异性高、灵敏度高、准确度高、精确度高、检测快速等特点。

主权项

一种克伦特罗单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述克伦特罗单克隆抗体采用合成的克伦特罗半抗原与载体蛋白偶联得到的抗原进行动物免疫而得到的，包括以下步骤：(1)将克伦特罗半抗原与牛血清白蛋白偶联得到的免疫原对8‑10周龄的Balb/c小鼠进行三次间隔免疫，在第三次免疫后再进行一次加强免疫，激活体内的淋巴细胞，产生克伦特罗特异性抗体；(2)将产生克伦特罗特异性抗体的Balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按8∶1比例进行融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔，将阳性细胞采用有限稀释法进行亚克隆，得到稳定的能够分泌克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞；(3)用液体石蜡致敏Balb/c小鼠，将收集得到的杂交瘤细胞株用1640进行清洗，并注射于小鼠的腹腔，采集到的腹水用辛酸‑饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水放入‑20℃环境保存；其中，所述克伦特罗半抗原的合成方法包括下述步骤：①1.0‑10.0g盐酸克伦特罗加入到20‑100ml二甲基甲酰胺中，加入5‑25ml三乙胺和10％‑20％摩尔当量的4‑二甲氨基吡啶；1.1‑1.5摩尔当量的叔丁基二甲基氯硅烷加入到10‑50ml二甲基甲酰胺中，0℃下滴加入前述盐酸克伦特罗溶液中，滴加完毕后，室温继续反应1‑10小时，蒸除大部分溶剂，加水，乙酸乙酯萃取，水洗，干燥，除去溶剂后在环己烷‑乙酸乙酯中重结晶得到白色固体，为O‑硅烷化克伦特罗；②1.0‑5.0g步骤①所得产物，加入20‑50ml二甲基甲酰胺溶解，加入0.5‑1.5g NaOH；1.1‑1.5摩尔当量的溴丁酸乙酯加入到10‑20ml二甲基甲酰胺中，搅拌下滴加入前述O‑硅烷化克伦特罗溶液中，室温至60℃反应10‑20小时，乙酸乙酯萃取，水洗，干燥，除去溶剂后在环己烷‑乙酸乙酯中重结晶得到白色固体，为O‑硅烷化‑N‑烷基化克伦特罗；③1.0‑3.0g步骤②中产物，溶入50‑100ml四氢呋喃中，加入1.5‑2.0摩尔当量的氟化四丁基胺，室温反应10‑20小时，蒸除溶剂，乙酸乙酯溶解，水洗，干燥，除去溶剂后在环己烷‑乙酸乙酯中重结晶得到白色固体；④0.87‑1.74g步骤③产物，融入50‑100ml 1∶1乙醇/水溶液中，加入0.38‑0.76g硼氢化钠，室温反应5‑10小时后，除去溶剂，异丙醇中重结晶得到粘稠状物质或者白色无定形固体，为克伦特罗半抗原。