胃癌靶向FUT3基因的miRNAs表达载体的构建、筛选及其用途

摘要

本发明涉及胃癌靶向FUT3基因的miRNAs表达载体的构建、筛选及其用途，以pcDNA^TM6.2－GW/EmGFP－miR RNAi Expression Vector为载体，针对FUT3基因编码区中、上游的两段序列，在可较高表达Lewis血型抗原的胃腺癌细胞系KATO－III中发挥RNA干扰作用。这两段FUT3特异性RNA干涉靶序列分别为：①5’－AACTGCAGCAGGAATCCAGGT－3’，起始于1660位；②5’－AACCCATACAGTGAATCCATT－3’，起始于596位，是用于由FUT3基因调控的路易斯(Lewis)抗原相关性胃癌的治疗性物质。

主权项

1.靶向FUT3基因的miRNAs表达载体，其特征是，以pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR RNAiExpression Vector为载体，针对人α-1，3/4-岩藻糖基转移酶(FUT3)基因编码区中、上游的两段序列，在较高表达路易斯(Lewis)血型抗原的胃癌细胞系KATO-III中发挥RNA干扰作用，这两段FUT3特异性RNA干涉靶序列分别为：①5’-AACTGCAGCAGGAATCCAGGT-3’，起始于1660位；②5’-AACCCATACAGTGAATCCATT-3’，起始于596位，是用于由FUT3基因调控的Lewis抗原相关性胃癌的治疗性物质，由以下方法制得：(1)RNA干涉靶序列的选择及插入序列的设计与合成选择FUT3基因编码区的两段序列①5’-AACTGCAGCAGGAATCCAGGT-3’、②5’-AACCCATACAGTGAATCCATT-3’，设计并分别体外合成两段互补的寡核苷酸序列，序列如下：①FUT3寡核苷酸序列1：正义链：5’-tgctGACCTGGATTCCTGCTGCAGTTGTTTTGGCCACTGACTGACAACTGCAGGGAATCCAGGT-3’反义链：5’-cctgACCTGGATTCCCTGCAGTTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAACTGCAGCAGGAATCCAGGTC-3’②FUT3寡核苷酸序列2：正义链：5’-tgctGAATGGATTCACTGTATGGGTTGTTTTGGCCACTGACTGACAACCCATAGTGAATCCATT-3’反义链：5’-cctgAATGGATTCACTATGGGTTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAACCCATACAGTGAATCCATTC-3’(2)将上述合成的寡核苷酸分别与线性载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR RNAiExpression Vector连接、转化、扩增及质粒的提取将步骤(1)合成的两段寡核苷酸等量混匀，95℃作用4分钟后慢慢冷却至室温，然后将结合的双链寡核苷酸与线性化的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR RNAi Expression Vector质粒载体连接，最后转化到One Shot TOP 10大肠杆菌，经壮观霉素(Spectinomycin)筛选，并用x-gal和IPTG(异丙基硫代-B-D-半乳糖苷)进行蓝白斑筛选，挑选耐药菌落大量培养，用质粒提试剂盒提取纯化质粒DNA；(3)质粒的鉴定将步骤(2)提取的质粒DNA琼脂糖凝胶电泳，应用引物EmGFP Forward sequencingprimer和miRNA reverse sequencing primer进行PCR鉴定，紫外分光光度计分析测定质粒DNA的浓度和纯度，并进行插入片断测序，以确定合成的寡核苷酸是否已正确转入pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR RNAi Expression Vector质粒中。