棉子携带黄萎病菌的检测方法

摘要

本发明涉及一种棉子携带黄萎病菌的免疫检测方法，其特征在于取种子样品1000粒以上置于网袋中，没有经过药物包衣的种子，用流水搓洗，而经药物包衣的种子反复搓洗至药物包衣完全洗尽后，将种子于阴凉处晾干。然后将晾干的种子样品加入含有适量抑制细菌生长的抗生素的查彼克培养液中培养。将预先处理的种子样品培养液与包被液等体积混合，温育处理；洗板，加入封闭液，温育；洗板，加入抗血清，温育；洗板，加入碱性磷酸酶标记的二抗，温育；洗板，加入底物液，温育；加入终止液终止反应。在405nm波长下，测定各孔的OD值，并计算样品平均OD₄₀₅值与阴性对照平均OD₄₀₅值的比值，判断种子样品是否携带黄萎病菌。本发明样品前处理简单，是一种简便、快速、灵敏、准确、廉价的检测方法，适合于各种子公司、检疫机构、科研单位等进行种子携带黄萎病菌的检测。

主权项

1. 一种棉子携带黄萎病菌的检测方法，其特征在于：a、所述的棉子样品应取1000粒以上置于网袋中，没有经过药物包衣的棉子，用流水搓洗，而经药物包衣的棉子反复搓洗至药物包衣完全洗尽，然后将棉子于阴凉处晾干；b、将晾干的棉子样品加入含有适量抑制细菌生长的抗生素的查彼克培养液中，振荡培养3d后取培养液，以5000r·min-1的离心速度进行离心30min后，取上清液作为待测棉子样品的培养液；c、将待测棉子样品的培养液用包被液1∶1稀释后，取100μL加至酶标板的反应孔中4℃过夜或37℃下孵育2h；并以标准抗原为阳性对照，空白培养液为阴性对照；d、取出酶标板，弃去包被液，用PBST洗板3次，甩干，并在每孔中加入300μL封闭液，37℃保温1h；e、取出酶标板，弃去封闭液，用PBST洗板3次，甩干，每孔加入100μL用封闭液稀释的抗血清，37℃下保温1h；f、取出酶标板，弃去用封闭液稀释的抗血清，用PBST洗板3次，甩干，每孔加入100μL用封闭液稀释的碱性磷酸酶标记的二抗，于37℃下保温1h；g、取出酶标板，弃去用封闭液稀释的二抗，用PBST洗板3次，甩干，每孔加入100μL新配制的含1g·L-1对硝基苯磷酸盐底物显色液37℃下显色；h、每孔加入50μL终止液终止反应，终止反应后，用吸水纸吸干酶标板底部，将酶标板置于酶标仪上，在405nm波长下，测定各孔的OD值；i、按公式：P/N＝样品平均OD405值/阴性对照平均OD405值，计算ELISA检测的P/N值；j、以P/N≥2判为阳性，认定该棉子样品携带有黄萎病菌。