| 主权项 |
1.一种制备活的带状 疹病毒(VZV)疫苗之方法,此方法包括:a.将选自人类二倍体细胞中疑似被VZV感染之细胞,于单层培养中培养至呈长满一层,其条件为达成细胞高度复制之充份高度营养,并添加有不可代谢之双醣糖;b.将依(a)步骤培养之细胞,尽可能在接近长满一层时间点时以实际上高感染复制力之VZV-感染细胞感染之;c.维持VZV感染培养于高度营养状态下约22-96小时,且于传染性VZV产制高峰时回收;d.以生理溶液洗涤被VZV感染之培养物,其中视所需的含有亲溶体剂,如氯化铵或氯奎,再回收被VZV感染之细胞;e.将被VZV感染之细胞回收至小体积的稳定剂溶液中,可立即瓦解细胞或将之冷冻待日后再瓦解;f.瓦解被VZV感染之细胞,以最佳地释出与细胞相连之VZV,并移出细胞残屑,生成无细胞之VZV制剂;其中疑似被VZV感染细胞为MRC-5细胞,减毒之VZV为水痘带状疹病毒之Oka株,培养温度介于约30-37℃间,双醣是蔗糖约20-60mM,且培养温度为约35℃,MOI(感染复数)在约1:25及1:625之间,亲溶体剂为氯化铵,介于约20-50mM之间,或氯奎在约230M下,高度营养之培养基为SRFE-2,视所需添加约0.02-0.4毫克/毫升大豆脂质,且病毒以超音波震荡或DOUNCE匀浆化作用,或二者方法自细胞中释出。2.一种制备活的减毒、无细胞水痘带状 疹病毒(VZV)疫苗之方法,此方法包括:a.培养MRC-5细胞至长满一层,其中该培养包括:1.于EBME之细胞种植期,2.于SRFE-2之细胞生长期,其中添加有约0.2毫克/毫升大豆脂质,始于细胞种殖后约3天3.感染前期,包括MRC-5细胞曝于20-50mM蔗糖下,于感染前历约24-96小时;b.将依(a)步骤培养之细胞,在尽可能接近长满一层时,以高感染复数之被减毒VZV感染之MRC-5细胞感染;c.维持被VZV感染之培养约37-96小时,再于VZV产制峰时回收之;d.以磷酸盐缓冲之食盐水洗涤培养物,并视所需添加1-100mM NH4Cl或氯奎;e.回收被VZV感染之MRC-5细胞,系:1.移去液体,2.添加少量稳定剂,其中视所需含有约1-100mM NH4Cl或约230M氯奎;3.磨擦细胞或化学地释出细胞4.视所需将释出之被VZV-感染细胞冷冻于-70℃下;f.瓦解释出之被VZV-感染细胞,采用:1.DOUNCE匀浆化作用,2.使残屑成团块,再保留上清液,3.将团块超音波震荡再使成团块之,及4.混合f-2步骤或f-3步骤之上清液;g.将(f)步骤产物稀释于稳定剂中,再将产物充填至单位剂量中施以冷冻乾燥,并贮于4℃或低于4℃,以致后来使用时,每剂中可应用者不会低于约1000PFU(噬菌斑形成单位)。3.一种于用于提高病毒疫苗产制之单层中培养细胞之方法,此方法包括:a.在培养容器中将细胞原始品种于最低营养要求或丰富培养基中,并令细胞培养约24-72小时;b.将a步骤培养物中之培养基移去,更换以新鲜、添加有最适合浓度之脂质之丰富培养基,且视所需包括有血清添加物;c.于添加有脂质之丰富培养基中培养细胞;d.视所需于生长约24-72小时后,将c步骤之培养基以不含脂质添加物之新鲜培养基取代之;其中培养温度介于约30-37℃间,丰富培养基是SRFE-2,视所需添加有胎牛血清、脂质添加物介于约0.2毫克/毫升及0.4毫克/毫升之间,且该细胞为MRC-5.WI-38或Vero细胞。4.一种用于将细胞于单层培养中生长之组成物,其中包括添加有约0.2-0.4毫克/毫升脂质之SRFE-2培养基,且该细胞为MRC-5.WI-38或Vero细胞,其中该SRFE-2培养基以毫克/升为基准,含有:图式简单说明:第一图于添加有蔗糖之培养基中VZV PFU之产率。第二图无细胞之VZV抗原产率第三图于SPGA稳定剂中,于-20℃或4℃下之VZV稳定性第四图利用不同的培养基达到VZV PFU产率第五图输入之与细胞相关MOI对无细胞VZV产率上之影响。 |
