| 摘要 |
Przedmiotem wynalazku jest eukariotyczny wektor ekspresyjny pcDNA3-PTGIS, przedstawiony wzorem ogólnym 1, który tworzy plazmid pcDNA3, zawierający fragment cDNA dla genu syntazy prostacykliny o łącznej długości 1566 pz, obejmujący sekwencję od 51 do 1598, według sekwencji zdeponowanej w Banku Genów pod numerem NM_000961 i jest ograniczony dodatkowymi sekwencjami restrykcyjnymi dla enzymów NheI i MluI, przedstawionymi w sekwencji nr 1. Ponadto fragment cDNA dla PTGIS stanowi sekwencję kodującą tego genu, zawierający kodon ATG, stanowiący sygnał do rozpoczęcie procesu translacji oraz kodon TGA, będący sygnałem zakończenia syntezy białka. Zgłoszenie dotyczy też sposobu wytwarzania eukariotycznego wektora, polegającego na tym, że z materiału genetycznego w postaci RNA izolowanego z ludzkich tkanek naczyń krwionośnych, otrzymuje się sekwencję cDNA dla PTGIS, zapisaną w sekwencji 1, poprzez przeprowadzenie reakcji odwrotnej transkrypcji z udziałem oligo(dT), w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) z udziałem specyficznych starterów, przedstawionych w sekwencji 2 i 3, prowadzi się amplifikację fragmentów cDNA dla PTGIS, które wklonowuje się do wektora plazmidowego pCR2.1-TOPO (Invitrogen). Otrzymany konstrukt DNA wprowadza się do bakterii kompetentnych Escherichia coli, z pojedynczych klonów bakteryjnych, izoluje się plazmidowe DNA, przy czym plazmid zawierający sekwencję cDNA dla PTGIS w orientacji sens poddaje się trawieniu enzymami restrykcyjnymi KpnI i NotI, uzyskany fragment, odpowiadający cDNA dla PTGIS, wprowadza się do eukariotycznego wektora ekspresyjnego pcDNA3, przy użyciu enzymu ligazy T4, w orientacji sens wobec promotora CMV IE, na odpowiednie miejsca restrykcyjne. Zgłoszenie obejmuje także zastosowanie wektora kodującego ludzki enzym syntazy prostacykliny, do wytwarzania leku w postaci iniekcji do terapii chorych cierpiących na krytyczne niedokrwienie kończyn dolnych oraz chorych z trudno gojącymi się ranami. |
