零背景克隆载体及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了制备零背景克隆载体的方法及应用。其中，制备零背景克隆载体的方法，包括以下步骤：提供SEQ ID NO：6所示的DNA片段；以pUC19质粒为模板，利用SEQ ID NO：7‑8所示的引物进行第一PCR扩增，以便获得pUC19载体片段；将DNA片段与pUC19载体片段进行同源重组，以便获得载体骨架；将载体骨架转化感受态细胞并提取质粒，以便获得零背景克隆载体的前载体；以及采用EcoRV酶对零背景克隆载体的前载体进行酶切，以便得到零背景克隆载体。该方法获得的载体可直接用于平末端产物的连接，载体自连的背景低，克隆的阳性率高，无需蓝白筛选，能在短时间内实现快速有效的克隆，克隆效率高，效果好。

主权项

一种制备零背景克隆载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：通过以下步骤提供SEQ ID NO：6所示的DNA片段：将SEQ ID NO：9‑69所示的引物混合，以便获得引物混合物；对所述引物混合物进行第二PCR扩增，以便获得第二PCR扩增产物；以及利用SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：69所示的引物，将所述第二PCR扩增产物进行第三PCR扩增，以便获得第三PCR扩增产物，所述第三PCR扩增产物即为SEQ ID NO：6所示的DNA片段，其中，所述第二PCR扩增的反应体系为：10微升50微摩尔的所述引物混合物、0.5微升高保真DNA聚合酶、10微升5X第二PCR反应混合液，双蒸水补足至50微升，所述第二PCR扩增的反应程序为：95℃3分钟；94℃30秒，55℃退火30秒，68℃1分钟，循环25次；68℃5分钟；冷却至室温，所述第三PCR扩增的反应体系为：0.5微升50微摩尔SEQ ID NO:9所示的引物，0.5微升50微摩尔SEQ ID NO：69所示的引物，0.5微升高保真DNA聚合酶、10微升5X第三PCR反应混合液，1微升所述第二PCR扩增产物，双蒸水补足至50微升，所述第三PCR扩增的反应程序为：95℃3分钟；94℃30秒，55℃退火30秒，68℃2分钟，循环30次；68℃5分钟；冷却至室温；以pUC19质粒为模板，利用SEQ ID NO：7‑8所示的引物进行第一PCR扩增，以便获得pUC19载体片段，其中，所述第一PCR扩增的反应体系为：0.5微升10微摩尔SEQ ID NO:7所示的引物，0.5微升10微摩尔SEQ ID NO：8所示的引物，10纳克pUC19质粒，0.5微升高保真DNA聚合酶、10微升5X第一PCR反应混合液，双蒸水补足至50微升，所述第一PCR扩增的反应程序为：95℃3分钟；94℃30秒，55℃退火30秒，68℃2分钟，循环30次；68℃5分钟；冷却至室温；利用基因克隆试剂盒将所述DNA片段与所述pUC19载体片段于室温下进行同源重组30分钟，以便获得载体骨架，其中，所述同源重组的反应体系为：10微升2X基因克隆反应混合液，5微升所述DNA片段、2微升所述pUC19载体片段，双蒸水补足至50微升；将所述载体骨架转化大肠杆菌感受态细胞DB3.1并提取质粒，以便获得零背景克隆载体的前载体；以及采用EcoRV酶对所述零背景克隆载体的前载体于37℃下进行酶切2‑4小时，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并回收纯化约3000碱基的大片段，所述大片段即为所述零背景克隆载体，其中，所述酶切的反应体系为：10微升10X酶切缓冲液，1‑10微克所述零背景克隆载体的前载体、1‑10微升10U/微升EcoRV酶，双蒸水补足至100微升。