一种生物法降解烟草浸出液中甾醇类化合物的方法

摘要

本发明公开了一种生物法降解烟草浸出液中甾醇类化合物的方法：通过培养基从烟草表面分离甾醇降解菌，利用种子培养基扩大培养该微生物，搜集对数期细胞，接种于烟草浸提液，发酵。本发明从烟叶表面分离获得降解甾醇的微生物，利用种子培养基进行扩大后获得对数期细胞，添加到烟草浸提液中可以有效降解其中的甾醇含量，甾醇总降解率达到35.5%。甾醇为烟草有害物质苯并芘的前体化合物，该发明为烟草生物减害提供参考，具有很高的原创性，有望应用于降低苯并芘的再造烟叶生产过程。

主权项

一种生物法降解烟草浸出液中甾醇类化合物的方法，其特征在于：通过培养基从烟草表面分离甾醇降解菌，利用种子培养基扩大培养该微生物，搜集对数期细胞，接种于烟草浸提液，发酵；步骤如下：(1)降甾醇微生物的分离：用无菌水洗涤烟叶表面2‑3次，收集沉淀，将沉淀用15ml pH7.0的磷酸缓冲液稀释后，按照10％接种量接种到分离培养基中，37℃摇床中，150r/min培养，于富集培养基中富集培养3次后，取200μl培养液涂于固体平板上，培养48h后获得可降解甾醇的微生物单菌落；(2)微生物扩大培养：挑取步骤(1)中的单菌落到种子培养基中，于37℃摇床中，150r/min培养48小时，获得种子培养液，保存于4℃，同时取0.5ml菌液加0.5ml的50％甘油混匀后保存于‑20℃；(3)以步骤(2)中的种子培养液为种子，重新取1ml接种到50ml新鲜的种子培养液中，相同条件下培养48小时，每隔5小时取2ml菌液，测定OD值，在18‑52h收集细胞，分别在6000转，4℃下离心30min，去掉上清液；(4)甾醇降解条件：收集18‑52h的细胞，并以质量1：50的比例将干细胞加入到烟草浸提液中，置于37℃的摇床中，150r/min下发酵2‑8h；所述步骤(1)中分离培养基的组分：以分离培养基总量1L计，豆甾醇2.0±0.1g；葡萄糖2.0±0.1g；失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚1±0.1ml；柠檬酸2.0±0.1g；K₂HPO₄ 0.5±0.01g；NH₄Cl 1.0±0.1g；余量为水。