| 主权项 |
一种苯二氮卓人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备人工半抗原：(a)将氯氮卓溶于无水吡啶，加入乙酸酐，室温静置反应14小时以上；减压浓缩，加入乙醚：石油醚＝1：1溶剂，冰水浴结晶，移除溶液，固体用二氯甲烷溶解后减压浓缩；重复以上操作至TLC检测显示只有1个点，蒸干后称重，得产物Ⅰ；TLC层析液：正庚烷：三氯甲烷：乙酸：乙醇95％＝5:5:1:0.3(v/v)；(b)产物Ⅰ按比例加入1，4‑二氧六环溶解后，加入1N盐酸，室温静置14小时以上，反应比例：产物Ⅰ：1，4‑二氧六环：1N盐酸＝85.4g：1250ml：250ml；用1N氢氧化钠调反应液pH＝8～9，用乙醚萃取，收集有机相用pH＝9～10的氢氧化钠水溶液萃取，得到的水相用乙酸调pH＝7后，用二氯甲烷萃取，收集有机相减压浓缩，加入少量石油醚，使固体析出，蒸干得产物Ⅱ；(c)产物Ⅱ溶于乙酸酐中，反应比例：产物Ⅱ：乙酸酐＝1g：10ml，94℃下反应20～23分钟，冷却结晶过夜；移除溶液，固体用乙酸酐洗涤；加入95％乙醇，减压蒸干，得产物Ⅲ；(d)产物Ⅲ加入95％乙醇和4N氢氧化钠，反应比例：产物Ⅲ：95％乙醇：4N氢氧化钠＝3.4g：80ml：6ml，得乳白色悬浊物，加入与95％乙醇体积相同的纯化水溶解，用乙酸调至酸性，析出沉淀后，过滤，滤渣放入40℃烘箱中干燥过夜，得产物Ⅳ；(e)称取200mg产物Ⅳ，溶于5ml无水吡啶中，加入250mg丁二酸酐，95～105℃反应16小时以上；反应结束后，将溶剂减压蒸干，用38％的碳酸钾溶解，用乙酸乙酯萃取，收集水相，用盐酸调pH＝5，用乙酸乙酯萃取，收集有机相，再用饱和氯化钠萃取，有机相减压蒸干，得苯二氮卓半抗原；(2)制备苯二氮卓人工抗原：(f)将苯二氮卓半抗原溶于N,N‑二甲基甲酰胺中，加入N‑羟基琥珀酰亚胺、环己基碳酰二亚胺，反应比例：苯二氮卓半抗原：N,N‑二甲基甲酰胺：N‑羟基琥珀酰亚胺：环己基碳酰二亚胺＝200mg：10ml：200mg：288mg，室温搅拌反应16小时以上，反应结束后离心取上清液记为A液；(d)将氯化钠与十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠以摩尔比为78.3:4.2:1溶于双蒸水中，制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，pH为7.2～7.4；(e)将牛血清蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的B液；(f)将A液缓慢滴加到B液，A液与B液的体积比为1:5，得到的混合液在2‑8℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液；(g)将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：苯二氮卓‑牛血清蛋白。 |
