利用双重PCR技术筛选产发菜多糖重组酵母菌株的方法

摘要

本发明公开了一种利用双重PCR技术筛选产发菜多糖重组酵母菌株的方法，利用酵母DNA提取试剂盒提取发菜酵母重组菌株，提取重组菌株基因组DNA；设计引物序列为5’‑3’的引物1和引物序列为5’‑3’的引物2，引物1；进行单重PCR扩增，再进行双重PCR扩增；对Pho1 F/R和Pho2 F/R两对引物进行引物配比，扩增PCR；用双重PCR扩增体系，对产发菜多糖重组酵母菌株进行筛选。该筛选方法可以一次性扩增和筛选96个重组菌株，大大缩短筛选时间，节省筛选成本，提高筛选效率，实现高通量筛选；可以短时间完成整个实验筛选过程，防止长时间筛选过程对菌种的污染，减少污染率和菌种的储藏成本。

主权项

一种利用双重PCR技术筛选产发菜多糖重组酵母菌株的方法，其特征在于，该筛选方法具体按以下步骤进行：步骤1：利用酵母DNA提取试剂盒提取发菜酵母重组菌株，提取重组菌株基因组DNA；步骤2：设计引物序列为5’‑3’ 的引物1和引物序列为5’‑3’ 的引物2；步骤3： PCR总体积为25μL，其中包括2×Taq PCRMaster Mix 10.5μL，上游引物 1.0μL，下游引物1.0μL，模板 DNA 1.5μL，其余用水补足；反应程序：94 ℃变性2 min；94 ℃20 s ，52 ℃ 25 s ，72 ℃ 30 s，18个循环；72 ℃延伸2 min；进行单重PCR扩增：步骤4：模板 DNA 3μl，双重引物上下游各加1.5μl，2×Taq PCRMaster Mix 10.5μL，加 ddH₂O 至25μl；扩增PCR 反应程序为 94℃变性 2min；然后 94℃，20sec、52℃，25sec、72℃，30sec，进行 20 个循环；最后 72℃延伸 2min，4℃保温，进行双重PCR扩增，扩增产物在 ‑20℃保存；步骤5：对Pho1 F/R和Pho2 F/R两对引物进行引物配比，双重PCR扩增体系为：模板 DNA 3μl，2×Taq PCRMaster Mix 10.5μL，引物浓度分别为1.5μl，加 ddH₂O 至25μl，扩增PCR 反应程序为：94℃变性 2min；然后 94℃，20sec、52℃，25sec、72℃，30sec，进行 20 个循环；最后 72℃延伸 2min，4℃保温；步骤6：用步骤5得到的双重PCR扩增体系，对产发菜多糖重组酵母菌株进行筛选。