带KT3标签的重组病毒rPCV2‑KT3的构建方法

摘要

带KT3标签的重组病毒rPCV2‑KT3的构建方法，涉及检测PCV2病毒的克隆体的构建方法，包括KT3标签引物的设计、感染性克隆（rPCV2‑KT3）的构建。本发明建立的感染性克隆（rPCV2‑KT3）可用作PCV2感染PCR诊断的标准阳性对照；用于疫苗免疫效果评价中抗体水平测定的靶抗原及临床诊断中PCV2病毒分离的阳性对照。

主权项

带KT3标签的重组病毒rPCV2‑KT3的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1）引物设计：设计PCV2全长引物，所述PCV2全长引物的上、下游引物的5’端插入病毒基因组自带的Sac II限制性内切酶酶切位点；设计在PCV2全基因组的ORF2的羧基端插入含猿猴病毒40大T抗原标签的引入KT3的上下游引物；以PCV2唯一的酶切位点Nco I设计一对鉴定pSK‑KT3‑dPCV2双拷贝重组质粒用引物；2）PCV2病毒DNA的提取；3）将步骤2）中获得的病毒DNA使用步骤1）设计的引物利用重叠延伸PCR的方法，扩增带KT3标签的PCV2全基因组；4）胶回收PCR产物并连接至pMD®19‑T Vector，获得重组质粒pSK‑KT3‑dPCV2；5）将重组质粒pSK‑KT3‑dPCV2转化大肠杆菌DH5α，获得重组质粒T‑sPCV2‑KT3；6）构建pSK‑KT3‑sPCV2单拷贝重组质粒；7）构建pSK‑KT3‑dPCV2双拷贝重组质粒；8）电转化Dulac细胞并进行传代培养，获得带KT3标签的rPCV2‑KT3重组病毒。