检测炎症性肌病NXP2自身抗体的非放射标记免疫沉淀方法与应用

摘要

本申请公开了检测炎症性肌病NXP2自身抗体的非放射标记免疫沉淀方法与应用，通过构建含NXP2 N端(1‑500aa)或NXP2 C端(400‑939aa)并且带有Myc标签的质粒pCMV‑myc‑NXP2N或pCMV‑myc‑NXP2C，瞬时转染HEK293细胞，NXP2自身抗体阳性的炎症性肌病患者血清与过表达NXP2 N端或NXP2 C端的HEK293细胞裂解液进行免疫沉淀，发现NXP2 N端或NXP2 C端均被NXP2自身抗体沉淀；将炎症性肌病患者的待测血清与过表达NXP2 C端的HEK293细胞裂解液进行免疫沉淀，然后进行SDS‑PAGE凝胶电泳，用c‑myc抗体检测沉淀的NXP2 C端，确定炎症性肌病患者血清中是否具有NXP2自身抗体，解决目前国内还没有商业化的检测NXP2抗体的ELISA试剂盒以及免疫印迹膜条的问题，以及自行包被NXP2抗原的ELISA试剂盒的高成本、高假阳性率和放射标记免疫沉淀法的安全性等问题。

主权项

检测炎症性肌病NXP2自身抗体的非放射标记免疫沉淀方法，其特征在于，包括以下步骤：1)利用引物对NXP2‑F/NXP‑R2和引物对NXP2‑F2/NXP2‑R从pCMV‑myc‑NXP2全长质粒中分别PCR扩增人NXP2的N端或C端；2)回收纯化PCR产物，然后克隆至pCMV‑myc载体，构建含NXP2N端或NXP2C端并且带有Myc标签的pCMV‑myc‑NXP2N或pCMV‑myc‑NXP2C质粒，通过酶切鉴定确定所述pCMV‑myc‑NXP2N或pCMV‑myc‑NXP2C质粒的插入子；3)测序证实所述pCMV‑myc‑NXP2N或pCMV‑myc‑NXP2C质粒中的NXP2N端或NXP2C端序列和读码框的准确性；4)将所述pCMV‑myc‑NXP2N或pCMV‑myc‑NXP2C质粒瞬时转染人胚肾(HEK)293细胞48小时，通过Western Blot法使用c‑myc抗体或NXP2抗体检测所述pCMV‑myc‑NXP2N或pCMV‑myc‑NXP2C质粒的NXP2N端或NXP2C端在HEK293细胞中的过表达；5)采集30ul NXP2抗体阳性的炎症性肌病患者血清或健康对照血清分别与200ug所述过表达的NXP2N端或NXP2C端的细胞裂解液进行免疫沉淀，然后进行SDS‑PAGE凝胶电泳，用c‑myc抗体进行检测。