H6亚型禽流感病毒荧光定量RT‑PCR检测方法

摘要

本发明涉及一种H6亚型禽流感病毒荧光定量RT‑PCR检测方法。是参照GenBank中公开发表的H6亚型禽流感病毒HA基因序列，设计一组仅在H6亚型禽流感病毒血凝素基因间保守的特异性引物，再提取病毒RNA进行RT‑PCR扩增，制备质粒标准阳性模板，应用荧光定量检测仪通过绘制荧光定量PCR标准曲线对样品定量检测；通过倍比稀释质粒标准品进行灵敏度检测得出检测的最低浓度为35.84copies/reaction；本发明灵敏度高、特异性强，操作简便准确，能极大缩短检测周期，为疫病的发现和防控提供宝贵时间和技术保障，并能尽量避免检测过程中可能造成的生物污染。

主权项

一种H6亚型禽流感病毒荧光定量RT‑PCR检测方法，其特征在于该检测方法步骤如下：(1)引物设计参照H6亚型禽流感病毒HA基因序列设计特异性引物：H6F‑1：AGCAAAAGCAGGGGH6R‑1：AGTAGAAACAAGGGTGTTTTH6F‑2：；TGTTTGGGACATACAAH6R‑2：CAAATGTTGCATCTGCAAGAC(2)病毒RNA提取①取H6亚型禽流感病毒悬液200μL，加入600μL Trizol液，混匀；②室温放置5min，加入0.2ml氯仿，盖紧离心管，混匀器上震荡离心管5秒，于4℃下12000g离心15min；③取上层水相于一新的离心管，加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀；④于4℃下12000g离心15min，小心弃去上清液，倒置于吸水纸上，再加入600μL75％乙醇，颠倒洗涤，；⑤于4℃下12000g离心10min，小心弃去上清液，倒置于吸水纸上；⑥小心弃去上清液，然后室温干燥5‑10min；⑦然后将RNA溶于无RNA酶水中5000g离心5s；(3)RT‑PCR扩增①反转录合成cDNA：反应体系包括：Random 6mers 2μl，dNTP Mixture 1μl，Template RNA 3μl，Rnase free dH₂O 5μl，混匀后65℃保温5min后，冰上迅速冷却；向其中加入5×PrimeScript Buffer 4μl，Rnase Inhibitor 0.5μl，PrimeScript RTase 1μl，加Rnase free dH₂O定容至20μl，缓慢混匀；30℃下反应10min；然后95℃5min使酶失活；②PCR扩增：PCR总体系为25μl，其中10×Buffer 2.5μl，dNTPs 2μl，上、下游引物H6F‑1和H6R‑1各1μl，Taq DNA聚合酶0.25μl，模板2μl，余下用灭菌ddH₂O补足；反应条件为：95℃预变性3min，然后95℃30s，53℃30s，72℃2min，进行40个循环，最后72℃延伸10min；反应结束后，取6μl PCR产物于1％琼脂凝胶中电泳；(4)质粒标准阳性模板的制备①确定阳性质粒：PCR产物在1％琼脂凝胶中电泳后，使用胶回收试剂盒提取DNA，然后将将目的片段与pMD18‑T载体连接，并转化到DH5α感受态细胞中，于氨苄青霉素酶培养基37℃培养过夜，挑选转化的单菌落进行单克隆培养，EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ双酶切鉴定挑取的阳性质粒，并进行测序分析，测定的序列与Genebank上的标准毒株序列对比分析，确定阳性质粒；②阳性质粒浓度的测定：质粒提取物使用超纯水10×稀释，在260nm与280nm波长下测定质粒的含量，根据公式计算每微升液体中质粒DNA的拷贝数；注：每个碱基的平均分子量为660(5)荧光定量PCR标准曲线绘制将上述阳性质粒DNA做荧光定量标准品，倍比稀释10⁷～10²copies/μL用于荧光定量PCR标准曲线绘制，扩增反应体系20μl，其中Passive Reference Dye 0.4μl，上下游引物H6F‑2和H6R‑2各0.4μl，2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix10μl，模板1μl，超纯水7.8μl；反应条件为：94℃ 30s；94℃ 5s，60℃ 15s，60℃ 34s，40个循环。