体液循环DNA定量检测方法及试剂盒

摘要

本发明公开了体液循环DNA定量检测方法及试剂盒。选择人单拷贝看家基因β‑actin为检测靶基因，人工合成一长度为45bp的双链DNA片段，其中包含25bp与β‑actin基因相同的序列，并重组至质粒载体T‑Vector pMD20中获得重组质粒DNA作为内标以一定量投入待测体液样本中，与体液循环DNA同步进行保存、核酸提取纯化和荧光定量PCR扩增，以用于体液循环DNA定量分析。本发明通过特殊内标的设立，消除了体液样本分析前和分析中由于核酸降解、提取丢失和PCR扩增效率不同而造成的检测偏差，能够对体液循环DNA进行更加稳定准确的定量检测。

主权项

一种非疾病诊断与治疗用途的体液循环DNA定量检测方法，其特征在于包括：人工合成带有“A”粘性末端、长度为45bp的线性双链DNA片段，线性双链DNA片段中有25bp序列与β‑actin基因相同，该线性双链DNA片段与T‑Vector pMD20质粒载体重组后，得到长度为2781bp的环状重组质粒DNA，经限制性内切酶Sma I酶切为线性双链DNA和紫外分光光度法定量后以一定量加入到待测样本中作为内标；提取待测样本的总DNA，同时包含待测循环DNA和内标，采用双重实时荧光定量PCR法同时扩增循环DNA中的人看家基因β‑actin和内标，按照内标的浓度计算被测体液中β‑actin基因浓度，以此得出循环DNA含量；其中，双重实时荧光定量PCR反应体系中包含：共用下游引物、分别针对内标和β‑actin基因的上游引物、以及分别标记JOE和FAM荧光基团的两个Taqman水解探针，JOE标记的探针针对β‑actin基因，FAM标记的探针针对内标，同步进行基因扩增定量检测；所述的线性双链DNA片段序列如SEQ ID NO.1所示；在双重实时荧光定量PCR扩增内标时，上游引物如SEQ ID NO.2所示，下游引物如SEQ ID NO.3所示，Taqman水解探针如SEQ ID NO.4所示，5’端标记荧光报告基团FAM；在双重实时荧光定量PCR扩增β‑actin基因时，上游引物如SEQ ID NO.5所示，共用下游引物同内标扩增下游引物如SEQ ID NO.3所示，Taqman水解探针序列如SEQ ID NO.6所示，5’端标记荧光报告基团JOE。