人A群链球菌量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种人A群链球菌量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用，其中检测卡包括底板、样品垫、结合垫、检测层以及吸水垫；结合垫包被有量子点标记的抗人A群链球菌纳米探针；检测层是由带有一条检测线及一条质控线的固相硝酸纤维素膜构成；检测线包被有鼠抗人A群链球菌M蛋白多克隆抗体；质控线包被有抗兔IgG；检测层粘贴在底板上；结合垫以及吸水垫分别与检测层以及底板粘贴在一起；样品垫设置在结合垫上方且与结合垫部分重合后分别与结合垫及底板粘贴在一起。本发明提出了一种具有操作简便、检测快速、可定量及高灵敏度等优点的人A群链球菌（M1，3，5，6，24血清型）量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用。

主权项

一种人A群链球菌量子点免疫层析检测卡的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：1)结合垫的制备：1.1)重组M‑His融合蛋白的制备、纯化：1.1.1)对人A群链球菌1，3，5，6，24型M蛋白进行生物信息学分析，分别获取其N端型特异性序列中含胞外抗原表位且不与其他抗原抗体起交叉反应的的肽段，分别标记为M1，M3，M5，M6及M24；1.1.2)找到步骤1.1.1)中所得到五个肽段一一对应的基因编码序列，按M1‑M3‑M5‑M6‑M24的顺序进行序列拼接并根据大肠杆菌中密码子的偏好性对该序列进行密码子优化，在上述经密码子优化后的重组基因的序列的5’端及3’端引入酶切位点并化学合成全基因序列，同时标记为m；所述标记为m的基因序列是:1.1.3)将步骤1.1.2)中所得到的m按分子生物学方法克隆入表达载体pET‑28a(+)后转入大肠杆菌中表达重组M‑His融合蛋白；所述重组M‑His融合蛋白以可溶性表达方式存在于菌体中；1.1.4)用镍柱纯化步骤1.1.3)所得到的重组蛋白，SDS‑PAGE检测其纯度后，以Bradford法测定蛋白质浓度，调整蛋白浓度为0.2mg/mL后备用；1.2)兔及鼠抗人A群链球菌M蛋白多克隆抗体IgG的制备：1.2.1)以步骤1.1.4)中所得到的重组M‑His融合蛋白为完全抗原，分别免疫新西兰大白兔及豚鼠；分别制备兔抗人A群链球菌M蛋白抗血清及鼠抗人A群链球菌M蛋白抗血清；所述兔抗人A群链球菌M蛋白抗血清及鼠抗人A群链球菌M蛋白抗血清的间接ELISA效价均大于1×10⁵；1.2.2)采用Protein G亲和层析柱分别纯化兔抗人A群链球菌M蛋白抗血清及鼠抗人A群链球菌M蛋白抗血清中的多克隆抗体IgG；1.2.3)用凯基Bradford蛋白含量检测试剂盒测定步骤1.2.2)所得到的二种多克隆抗体IgG的浓度，将其蛋白浓度均调整为3mg/mL后备用；1.3)量子点标记的抗人A群链球菌纳米探针的制备与纯化：1.3.1)向微量离心管中依次加入2nmol量子点、300nmol N‑羟基琥珀酰亚胺和300nmol碳二亚胺，以磷酸盐缓冲液定容为2ml，于旋转混合仪中，以15rpm，37℃反应30min后，透析去除过量的N‑羟基琥珀酰亚胺以及碳二亚胺；所述磷酸盐缓冲液中各组分含量分别为：2.9g/L磷酸氢二钠、0.295g/L磷酸二氢钠以及2g/L氯化钠，所述磷酸盐缓冲液的pH＝7.3；1.3.2)在活化的量子点中，加入4‑12nmol的步骤1.2)所制备的兔抗人A群链球菌M蛋白多克隆抗体IgG，避光反应2h，加入端氨基化聚乙二醇至终浓度为1.5％，封闭未反应的活化羧基位点，继续避光反应1h；用0.2μm PES滤器过滤除去抗体聚集物，然后将滤液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4℃下离心15min，除去未发生偶联反应的抗体和反应中的副产物；收集超滤离心管滤膜上层量子点‑抗体偶联物溶液，溶于2ml磷酸盐洗涤液中，再将此溶液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4℃下离心15min，收集超滤离心管滤膜上层量子点‑抗体偶联物溶液，溶于1ml磷酸盐保存液中，至此制得量子点标记的抗人A群链球菌纳米探针；所述磷酸盐洗涤液中各组分含量分别为：2.9g/L磷酸氢二钠、0.295g/L磷酸二氢钠、2g/L氯化钠、5ml/L吐温‑20以及1g/L叠氮钠；所述磷酸盐洗涤液的pH＝7.3；所述磷酸盐保存液中各组分含量分别为：2.9g/L磷酸氢二钠、0.295 g/L磷酸二氢钠、2g/L氯化钠、10g/L BSA以及1g/L叠氮钠；所述磷酸盐保存液的pH＝7.3；1.4)量子点标记抗体的负载：将聚酯纤维膜浸入步骤1.3.2)所得到的量子点标记的抗人A群链球菌纳米探针溶液中1h，取出，25℃干燥后4℃密封保存备用，至此制得结合垫；2)样品垫的制备：取玻璃纤维素膜一张，将玻璃纤维素膜在样品垫处理液中浸泡至少3h，再置于生物安全柜内37℃通风干燥后，25℃密封干燥保存；至此制得样品垫；所述样品垫处理液中各组分含量分别为：2.9g/L磷酸氢二钠、0.295g/L磷酸二氢钠、2g/L氯化钠、20g/L牛血清白蛋白、10ml/L吐温‑20、20g/L蔗糖以及5g/L聚乙烯吡咯烷酮，所述样品垫处理液的pH＝7.3；3)检测层的制备：3.1)将步骤1.2)制备的鼠抗人A群链球菌M蛋白多克隆抗体与抗兔IgG用磷酸盐缓冲液均调整至终浓度为0.5‑2.5mg/mL后备用；所述磷酸盐缓冲液中各组分含量分别为：2.9g/L磷酸氢二钠、0.295g/L磷酸二氢钠以及2g/L氯化钠，所述磷酸盐缓冲液的pH＝7.3；3.2)将稀释好的鼠抗人A群链球菌M蛋白多克隆抗体装入BIODOT划膜仪喷头中，设置0.8‑2.5μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上，形成检测线；将稀释好的抗兔IgG装入BIODOT划膜仪喷头中，设置0.8‑2.5μl/cm的量按照与检测线0.5‑0.8cm的间隔喷于硝酸纤维素膜上作为质控线；3.3)将喷有检测线以及质控线的硝酸纤维素膜在37℃干燥2h，4℃密封干燥保存；至此制得检测层；4)底板的制备将PVC材质的底板按实际要求裁剪后备用；5)吸水垫的制备将吸水滤纸按实际要求裁剪后备用；6)人A群链球菌量子点免疫层析检测卡的组装：6.1)将步骤4)所制备得到的底板上的粘性保护膜揭掉；6.2)将步骤3)所制备得到的检测层粘贴到底板的中部区域，并抹平膜面；6.3)将步骤5)所制备得到的吸水垫组装到底板上，使吸水垫的左边与检测层有部分重叠，同时将其右边缘与底板的右边缘对齐粘好并抹平；6.4)将步骤1)所制备得到的结合垫按部分重叠的方式重叠于硝酸纤维素膜的左边缘处，同时将结合垫粘于底板上；6.5)将步骤2)所制备得到样品垫按部分重叠的方式重叠于结合垫的左边缘处，另一边与底板的左边缘对齐，粘于底板上并抹平；6.6)将组装好的人A群链球菌量子点免疫层析检测卡进行裁剪，4℃密封干燥避光保存；所述步骤6.1)至步骤6.6)均是在生物安全柜内进行操作；所述人A群链球菌是人A群链球菌M1，3，5，6，24血清型。