杀死金黄色葡萄球菌的组合物及方法

摘要

本发明提供一种杀死金黄色葡萄球菌的方法，包括制备载体、药物调剂、制备孢子悬液、测定最低抑菌浓度MIC、制备金黄色葡萄球菌生物膜载体、药物对金黄色葡萄球菌生物膜作用和激光共聚焦显微镜观察，将亚抑菌浓度的黄芩苷破坏金黄色葡萄球菌生物膜后，结合最低杀菌浓度的万古霉素将金黄色葡萄球菌杀死。

主权项

一种杀死金黄色葡萄球菌的方法，包括制备载体、药物调剂、制备孢子悬液、测定最低抑菌浓度MIC、制备金黄色葡萄球菌生物膜载体、药物对金黄色葡萄球菌生物膜作用和激光共聚焦显微镜观察，其特征在于，具体步骤如下，（1）制备载体，用1×1cm²的聚氯乙烯薄片，用75%乙醇浸泡15~20min，作为载体；（2）药物调剂，将黄芩苷用DMSO溶解成浓度为8mg/ml溶液并用氢氧化钠调节pH为7.2~7.4，用无菌ddH₂O将万古霉素溶解成浓度为1mg/ml溶液，用滤菌器过滤，分装于1.5ml灭菌离心管，‑20~‑25℃标记保存；（3）制备孢子悬液，将金黄色葡萄球菌接种于TSA培养基中，35~37℃培养24h后，转接到另一TSA培养基中，35~37℃培养复壮24h后，挑选复壮后的菌株接种到20~25mlTSB‑G培养基中培养，35~37℃，转速180rpm/min培养12~14h，后用TSB‑G培养基稀释菌落至OD_600nm =0.1，备用； （4）测定最低抑菌浓度MIC，在无菌的96孔细胞培养板的第1至第10孔加入步骤（3）孢子悬液，加入孢子悬液的量为100μl，再将步骤（2）制备的黄芩苷和万古霉素分别置于两个无菌的96孔细胞培养板的第1至第10孔，第1孔加入量为50μl，第2~10孔依次倍比稀释至二倍终浓度，第11孔为步骤（3）制备孢子悬液的生长对照孔，第12孔为TSB‑G培养基，静置于35~37℃培养24h，获得黄芩苷和万古霉素最低抑菌浓度MIC，根据万古霉素的最低抑菌浓度MIC测定获得最低杀菌浓度MBC；（5）制备金黄色葡萄球菌生物膜载体，将复壮后的金黄色葡萄球菌接种在20‑30mlTSB‑G培养基中，置于温度为35~37℃、转速为200~250rpm/min的恒温床培养18~20h，后用分光光度计测定金黄色葡萄球菌液在波长600nm处OD值，用TSB‑G培养基将菌悬液稀释至OD600 =0. 1，后将2ml金黄色葡萄球菌放在步骤（1）制备的载体并置于24孔板底部中，35~37℃恒温培养72~144h，间隔24h用相同的TSB‑G培养基换液，并用无菌生理盐水漂洗载体；（6）药物对金黄色葡萄球菌生物膜作用，在不同时间段将步骤（5）制备的金黄色葡萄球菌生物膜载体置于24孔板各孔中，按步骤（4）获得黄芩苷的最低抑菌浓度MIC和万古霉素的最低杀菌浓度，加入亚抑菌浓度的黄芩苷，在各孔中分别加入黄芩苷和万古霉素，黄芩苷的浓度为128‑512μg/ml，万古霉素为3‑6μg/ml，剩余用TSB‑G培养基补足至每孔为2ml，调好药物后，置于35~37℃培养12~14h，（7）激光共聚焦显微镜观察，将步骤（6）的载体取出，用灭菌NS漂洗，去除游离菌，在载体上滴加50μl Molecular Probes溶液，后室温避光培养15~20min，再用灭菌NS漂洗荧光染液，置于激光共聚焦显微镜观察。