一种大肠杆菌水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法

摘要

本发明提供一种大肠杆菌水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法，包括：定点突变詹氏甲烷球菌的酪氨酸‑tRNA合成酶获得MjpPpaRS基因，将MjpPpaRS基因克隆到pIVEX2.4c质粒上，得到重组质粒pIVEX2.4c‑MjpPpaRS；将重组质粒pIVEX2.4c‑MjpPpaRS和pUC‑MjtRNA转化至大肠杆菌BL21，选取阳性转化子，发酵后制成大肠杆菌无细胞抽提物，建立无细胞表达体系；以pIVEX2.4c‑AqpZ为模板，对AQPZ的F10、F13和F17三个位点进行琥珀突变；向无细胞表达体系中添加去污剂可溶表达编入pPpa的AQPZ蛋白，利用亲和层析纯化获得定点编入pPpa的AQPZ蛋白。本发明利用大肠杆菌无细胞体系生产编入pPpa的AQPZ蛋白并利用亲和层析纯化获得该目标蛋白，非天然氨基酸的嵌入使得该水通道蛋白与磷脂的亲和性增强，使得相同的条件下水通道蛋白的嵌入后更稳定。

主权项

一种大肠杆菌水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法，包括以下步骤：（1）定点突变詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的酪氨酸‑tRNA合成酶(tyrosyl‑tRNA synthetase, TyrRS)，获得MjpPpaRS基因，使其可催化非天然氨基酸对丙炔氧基‑L‑苯丙氨酸(p‑propargyloxyphenylalanine, pPpa)合成对应氨酰tRNA，获得p15a‑MjpPpaRS质粒；将MjtRNA的基因(SEQ NO.2)克隆至质粒pUC19，获得质粒pUC‑MjtRNA；（2）将步骤（1）得到的质粒p15a‑MjpPpaRS和pUC‑MjtRNA同时转至大肠杆菌BL21 (DE3)中，选取阳性转化子，发酵后制成大肠杆菌无细胞抽提物，建立无细胞表达体系；（3）将MjpPpaRS基因克隆到pIVEX2.4c质粒上，获得重组质粒pIVEX2.4c‑MjpPpaRS；（4）以pIVEX2.4c‑AqpZ为模板，对AQPZ的F10、F13和F17三个位点进行琥珀突变，得到重组质粒pIVEX2.4c‑AqpZTAG；（5）将步骤（3）得到的重组质粒pIVEX2.4c‑MjpPpaRS和步骤（4）得到的载体pIVEX2.4c‑AqpZTAG加入步骤（2）获得的大肠杆菌无细胞体系中进行表达；（6）利用亲和层析分离纯化编入pPpa的AQPZ蛋白，并检测其滤水功能。